徐玉環(huán)，劉 穎，徐艷峰，黃 瀾，李彥紅，韓云林，鄧 巍，秦 川，朱 華

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室 北京 100021)

目前研究小鼠胚胎發(fā)育，國內外大多采用冰凍切片。但對于較大的小鼠胚胎和新生鼠由于各臟器的結構、密度差異較大易造成組織凍結不均勻，影響切片及染色效果。另外，冰凍切片不容易制作較薄的切片，染色后組織結構不如石蠟切片清晰。雖然新的病理技術不斷涌現(xiàn)，石蠟切片還是應用最廣，結果較可靠的一種病理制片技術。國內外學者通過石蠟切片研究小鼠胚胎發(fā)育，在脫水處理小鼠整體胚胎時多按不同胚齡和日齡分開操作，對于同時處理不同胚齡及日齡的小鼠，還未見報道。我室引入全自動密閉式組織脫水機多年，在實驗動物大體標本石蠟切片制備中的應用已較為成熟。本文嘗試使用全自動密閉式組織脫水機處理不同日齡的小鼠整體胚胎組織和新生鼠組織，進行包埋切片并進行觀察比較。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑

全自動密閉式組織脫水機，Leica ASP300型(德國原裝進口)。不銹鋼脫水籃，塑料包埋盒。4%中性甲醛、乙醇、二甲苯、蘇木素及伊紅Y染色液均為國產試劑(北京益利精細化學品有限公司)，石蠟(lot#1305083，Leica)。

1.2 不同胚齡及日齡小鼠整體標本的制備

斷頸處死孕鼠，取出胚胎，用0.01 mol/L的PBS清洗。胚齡14.5、15.5、16.5 d的胚胎清洗后直接置于4%中性甲醛中固定24 h以上，不需要取材；

我們原來制備不同胚齡及日齡小鼠整體標本是分開進行的。由于胚齡17 d皮膚具有成體皮膚組織結構特征，18 d以后皮膚的組織結構基本保持不變。因此在本次小鼠胚胎制備過程中，對胚齡17.5 d、18.5 d及日齡0、1、2 d小鼠的固定、取材方法及脫水程序進行了改進：在整體固定前先在局部注入固定液。由于不同胚齡的小鼠及新生鼠胸腹部及腦部體積相差不大，注射的固定液體積基本相同(表1)。對取材的厚度(表1)和二甲苯透明時間也做了改進(表2)。

表1 改進前、后不同胚齡及日齡小鼠整體標本制備的比較

表2 改進前、后脫水程序設定的比較

1.3 組織石蠟切片及染色

脫水后的組織經石蠟包埋制成蠟塊，常規(guī)切片(切片厚度4 μm)。石蠟切片經脫蠟至水進行HE染色，經梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片。

2 結果

2.1 胚齡18.5 d的小鼠胚胎HE染色比較

在小鼠胚胎制備過程中，我們選取18.5 d的小鼠胚胎對取材方法及脫水程序進行摸索改進。根據常規(guī)實驗動物脫水程序設定的18.5 d的小鼠胚胎經HE染色可見(圖1)：改進前，不能完整切片；改進后，切片完整，各組織結構清晰。

圖1 改進前后18.5 d小鼠整體胚胎比較

2.2 小鼠整體胚胎及新生鼠HE染色結果

改進后的方法同樣適用于小鼠整體胚胎14.5、15.5、16.5、17.5 d及新生鼠0、1和2 d。用改進后設定的程序經全自動密閉式組織脫水機制得的小鼠整體胚胎及新生鼠的蠟塊，切片時手感柔潤，蠟片平整光滑潤澤。染色后鏡下觀察可見胚胎及新生鼠各組織結構完整，層次清晰。如圖2所示：

圖2 胚齡14.5 d、15.5 d、16.5 d、17.5 d、18.5 d及日齡0 d、1 d、2 d的小鼠HE染色結果。E表示胚齡；D表示日齡。

3 討論

觀察大體標本后取材，制作石蠟切片，并對切片染色進行光學顯微鏡觀察，以對疾病作出診斷的常規(guī)病理技術是病理技術和病理診斷的基礎和核心，具有重要的實驗和臨床應用價值和不可替代的地位[1]。

疾病的研究和早期的胚胎發(fā)育聯(lián)系越來越緊密，新的基因工程技術的廣泛應該用使得胚胎研究成為基礎研究的重要組成部分[2]。胚胎發(fā)育迅速，不同日齡的胚胎在組織結構上相差很大[3]，目前可查的文獻記錄中多使用手工操作對胚胎進行脫水包埋，以適應不同日齡胚胎的切片要求[4,5]。但手工操作耗時費力，且很難進行批量操作，且由于多種條件的限制重復性較差。全自動密閉式組織脫水機以其安全高效和良好的處理效果等優(yōu)點，受到病理技術人員的青睞，在病理學、解剖學、動物學等實驗領域廣泛應用[6,7]。本研究通過實驗，不斷摸索，成功利用全自動密閉式組織脫水機制備了不同胎齡小鼠整體胚胎及不同日齡的新生鼠標本。

通過實驗處理小鼠整體胚胎及新生鼠組織，要注意以下幾點：首先是固定，固定一定要徹底，這是第一步也是不可逆轉的一步。由于不同時段胚胎大小不同，各個臟器的發(fā)育程度也不同，所以固定液浸入各臟器的時間有差別。尤其是肝臟，肺臟及腦部，即使固定時間超過24 h，由于固定液難以及時完全浸入到組織內部，最后也會出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。因此，對胎齡大于18 d的胚胎和新生鼠在整體固定前

增加了局部注射固定這個步驟。在注射過程中要注意兩點：緩慢注射避免造成對臟器的擠壓；選擇腔隙或組織分布較稀疏的部位注射，以免損傷組織，影響組織學觀察。其次是取材，取材厚度不宜超過3 mm，尤其是腦部組織。由于腦部組織磷脂含量高且與水結合牢固，不易脫出。取材太厚，會造成脫水不完全，不能完整切片。脫水時間也是方法中應該注意的，要照顧到胚胎的各個臟器均脫水完全又不能過度脫水。胚齡17 d以后皮膚具有成體皮膚組織結構特征，需要稍微增加二甲苯透明時間。和其他臟器相比，腦部所需脫水時間也要長一些，而肝臟和脾臟卻易脫水過度。在本次研究中，經過多次嘗試，在其它步驟保持不變的前提下，將第一步二甲苯透明的時間增加了5 min，使取材后不同胚齡及新生鼠整體標本可以同時脫水。最后就是脫水機換液，累計脫水達到600塊時，脫水機要換液，但換液時不要把全部液體更換成新的，而是逐級上移，只更換最后一個步驟的液體，使脫水過程更柔和。

應用改進過的方法處理的小鼠整體胚胎及新生鼠，其切片同樣可以用于免疫組化及特殊染色，這為小鼠胚胎及新生鼠的發(fā)育研究提供了基礎。

參考文獻：

[1] 董學易, 孫保存, 趙秀蘭, 等. 常規(guī)組織制片技術在病理學實驗教學中的應用 [J]. 基礎醫(yī)學教育, 2013, 15(7): 685-686.

[2] Pérez-Pomares JM, Foty RA. Tissue fusion and cell sorting in embryonic development and disease: biomedical implications [J]. Bioessays, 2006, 28(8): 809-821.

[3] Theiler K. The house mouse atlas of embryonic development (second printing) [M]. Springer-Verlag, New York. 1989: 1-185.

[4] 冉黎, 張全波, 陸長青, 等. 不同時期大鼠整胚石蠟標本的制備 [J]. 四川解剖學雜志, 2007, 15(3): 14-16.

[5] 劉淑琴, 秦建民, 曾錦章, 等. 不同時期小鼠胚胎整體石蠟標本的制備技術[J]. 解剖學雜志, 2005, 28(6): 721-723.

[6] 胡海霞, 劉俊堂, 熊正文. 全自動密閉式組織脫水機在石蠟切片組織處理中的應用 [J]. 中國組織化學與細胞化學雜志, 2007, 16(6): 738-739.

[7] 耿佳. 全自動密閉式組織脫水機的應用 [J]. 實用醫(yī)技雜志, 2010, 17(4): 376.