張 潔， 許 華

(1暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632； 2山西醫(yī)學科學院，山西大醫(yī)院藥劑科，山西 太原 030032)

在神經(jīng)組織所有膠質(zhì)細胞中，星形膠質(zhì)細胞(astrocytes, AST)數(shù)量最多，分布最廣。AST不僅與神經(jīng)元的功能活動及突觸傳遞等多種正常生理活動有關，而且與神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持、神經(jīng)組織的損傷與修復過程密切相關。近年來，星形膠質(zhì)細胞在癲癇發(fā)病過程中作用也越來越受到人們的關注[1]。它的異常改變除涉及到細胞數(shù)量、形態(tài)、代謝活動、蛋白合成等方面外，其細胞間縫隙連接及與縫隙連接密切相關的細胞骨架蛋白的結構變化也與癲癇發(fā)病機制有關。 紅藻氨酸(kainic acid, KA) 系紅海藻海人草(Digeneasimplex)的提取物，與興奮性氨基酸谷氨酸(glutamate, Glu)的結構相似，可誘發(fā)癲癇的發(fā)生，目前已被廣泛用作動物癲癇模型造模劑，但其昂貴的價格影響了其在研究中的應用。本研究所用的合成紅藻氨酸(synthetic kainic acid, SKA)，為KA的人工合成品。我們前期進行的動物實驗證明，SKA腹腔注射可誘發(fā)Wistar大鼠癲癇發(fā)作，具有作用穩(wěn)定、階段性明顯及死亡率較低的特點[2]。在此基礎上，本文模擬神經(jīng)元興奮環(huán)境下, 即高濃度KCl 環(huán)境下，研究SKA對大鼠原代AST骨架微絲蛋白——纖絲狀肌動蛋白(filamentous actin, F-actin)變化的影響，并使用細胞縫隙連接(gap junctions, GJ)通道阻滯劑1-庚醇(1-heptanol, 1-Hep)，探討SKA對AST細胞縫隙連接的影響，旨在闡明SKA誘發(fā)大鼠癲癇的作用機制，以期從新的角度為癲癇的防治提供科學依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動物 出生后24 h內(nèi)的Wistar大鼠乳鼠，雌雄不拘，購于中山醫(yī)科大學實驗動物中心，SPF級，實驗動物資格認可證號為2006A072。

1.2藥品及試劑 SKA由廣州諾東生物科技有限公司提供，白色針狀晶體，分子式：C10H15NO4·H2O，分子量為231.2；高效液相色譜法檢測結果顯示，其純度大于99%。對照品KA購自Sigma，膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體購自廣州儀濤科學儀器有限公司；DMED/F12培養(yǎng)液為Gibco產(chǎn)品；Cy3標記的抗兔IgG、DAPI和1-Hep均為Sigma產(chǎn)品；鬼筆環(huán)肽(rhodamine phallacidin R415)為Molecular Probes產(chǎn)品。

1.3主要儀器 LSM510 META激光共聚焦掃描顯微鏡(Carl Zeiss)；DMRA2型正立電動熒光顯微鏡(Leica)。

2 方法

2.1原代星形膠質(zhì)細胞的獲取 參照方法[3]，取新生24 h內(nèi)的Wistar大鼠乳鼠，無菌操作下分離出乳鼠大腦，置于含有冷DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剪碎組織，移入離心管中，按1∶1比例加入0.25%胰酶。15 min后終止消化，用200目濾網(wǎng)過濾，收集懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清液，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，輕輕吹打盡量使細胞分散存在；接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。差速貼壁40 min，去除成纖維細胞；收集未貼壁的細胞以4×109/L密度加入到25 cm2培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后換液；此后每3 d換液(15%胎牛血清的DMEM/F12)1次，繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d，可有效去除神經(jīng)元、神經(jīng)前體細胞、血細胞等。

2.2正常大鼠星形膠質(zhì)細胞的純化及傳代 上述原代細胞培養(yǎng)7～10 d，當細胞濃度達90%以上時，棄廢液、漂洗、加入新鮮完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中2 h；繼之于37 ℃、250 r/min恒溫搖床振蕩15～18 h，以去除少突膠質(zhì)細胞；棄上清液，加入新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)振蕩后的貼壁細胞；次日取出，PBS漂洗3次，加入0.125%胰酶及0.04% EDTA，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化2～3 min，鏡下觀察細胞收縮變圓時加入含胎牛血清的DMEM/F12終止消化，收集細胞懸液移入離心管，1 000 r/min離心5 min，去上清液，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12，按1∶3傳代。

2.3星形膠質(zhì)細胞鑒定 GFAP是AST細胞的主要成分。利用GFAP抗體,采用免疫熒光組化技術對培養(yǎng)細胞中的星形膠質(zhì)細胞進行鑒定[4]。

2.4實驗分組及各組F-actin免疫熒光檢測 在6孔板內(nèi)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞時，于培養(yǎng)皿內(nèi)放入載玻片(22 mm×22 mm)，制備細胞爬片。第7天待細胞將爬滿整個玻片時換液，進行藥物干預處理。將培養(yǎng)皿隨機分成5大組，每組3皿，分別為正常對照組(培養(yǎng)基)、高濃度KCl組(KCl濃度為20 mmol/L )、高濃度KCl+SKA組(又分為SKA不同濃度亞組，分別為SKA 5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和250 μmol/L亞組)、高濃度KCl+1-Hep(1 mmol/L)組及高濃度 KCl+1-Hep+SKA組(又分為SKA不同濃度亞組，分別為SKA 5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和250 μmol/L亞組)。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用PBS輕輕沖洗各組已爬滿細胞的玻片，加入FITC標記的鬼筆環(huán)肽(5 mg/L)，室溫孵育1 h，對星形膠質(zhì)細胞骨架蛋白F-actin進行直接免疫熒光染色[5]。將染色后的玻片置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，每張玻片選擇一個形態(tài)典型的星形膠質(zhì)細胞進行斷層掃描，獲取三維圖像，將圖像存入計算機，用Image-Pro Plus軟件進行熒光強度定量分析。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 (mean±SD) 表示，用SPSS 13.0軟件處理。采用方差分析進行組間差異比較，兩兩比較使用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 AST細胞原代培養(yǎng)及鑒定

1.1AST細胞的原代培養(yǎng)及純化 分離的大腦皮質(zhì)細胞在種植24 h后大多已貼壁，34 d后細胞數(shù)量增多，胞體明顯增大，部分細胞突起逐漸伸長。至7～10 d，細胞已長滿培養(yǎng)瓶壁，倒置相差顯微鏡下可見細胞分2層：表層細胞胞體較小，三角形和梭形胞體居多，胞體周圍有不同程度的光暈，突起多而細長；底層細胞形態(tài)相對較大，形態(tài)不規(guī)則，胞體暗，胞體周圍光暈不明顯，偶見突起。

利用搖床可使其它雜細胞脫落，經(jīng)振蕩純化后，原代培養(yǎng)物中的表層細胞基本消失，細胞形態(tài)以胞體較大的細胞為主，底層細胞近于純化。但隨著細胞傳代次數(shù)的增加，雜細胞生長迅速，AST細胞比例下降。因此，通過此法獲得的AST細胞的最佳使用時間是2代以內(nèi)的細胞。各時期細胞生長情況見圖1A～C。

1.2GFAP免疫組化鑒定結果 結果顯示，絕大多數(shù)細胞為GFAP陽性細胞，證明培養(yǎng)的細胞是AST細胞，鏡下胞體呈紅色、胞核顯藍色；而GFAP未表達細胞即非星形膠質(zhì)細胞，僅可見其藍色胞核，見圖1D。

Figure 1. Primary astrocytes cultured for 24 h (A), 72 h (B) and 8 d (C), and identified by GFAP immunofluorescence staining (D).A,C: ×50; B,D: ×50.

2 SKA對AST細胞 F-actin表達的影響

2.1正常AST細胞F-actin形態(tài)學結構 鏡下鬼筆環(huán)肽標記的F-actin呈橘紅色，分布在細胞胞質(zhì)，呈細束或細絲狀，沿細胞極性平行排列，在細胞邊緣處密集，鏡下可見細胞邊緣處熒光強度較強，逐層向內(nèi)漸弱，見圖2A；細胞突起部位F-actin呈現(xiàn)細絲狀或曲而不直，整齊排列，似毛刺，各毛刺間距大致相等，見圖2B，與非細胞突起區(qū)域筆直細線狀形態(tài)差別較大，鏡下可見其熒光強度較細胞內(nèi)部的F-actin弱。

Figure 2. Morphology of F-actin in the normal astrocyte (phalloidin direct immunofluorescence staining, ×200).A: F-actin in the normal astrocyte;B: intercellular F-actin filopodia-like protrusions.

2.2SKA對F-actin形態(tài)學的影響 KCl作用于AST細胞24 h后，熒光強度較正常對照組增強，可見F-actin細絲狀物比正常對照組明顯密集，見圖3A。同時給予KCl和SKA后，F(xiàn)-actin細絲狀物數(shù)目增多、增粗、密集，熒光強度明顯增強，表明SKA作用后F-actin表達增多，見圖3B、C。給予KCl+1-Hep后F-actin表達明顯降低，表現(xiàn)為細胞F-actin細絲狀物稀疏，熒光強度弱于KCl組；而KCl+SKA+1-Hep組F-actin絲狀線極細并愈加稀疏，有些熒光微弱，鏡下難以辨認，見圖3D。值得注意的是，所有1-Hep劑量組均可發(fā)現(xiàn)AST細胞內(nèi)的F-actin部分呈細絲狀斷裂，其斷端有長短不齊的細絲存在，見圖3E；有些則似被橫斷，斷面齊整,見圖3F。SKA不同劑量分組鏡下直接觀察F-actin形態(tài)排布差異較小。

2.3SKA對F-actin表達量的影響 高濃度的KCl作用于星形膠質(zhì)細胞24 h后，F(xiàn)-actin的熒光強度較正常對照組升高(P<0.01)；而給予KCl+SKA 24 h后F-actin的熒光強度較KCl組明顯升高(P<0.01)，且不同濃度SKA亞組的結果顯示，隨SKA劑量增加，F(xiàn)-actin熒光強度逐漸增強，但各組間差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

Figure 3. The effects of different treatments on the morphological changes of F-actin (×100).A: KCl group; B,C: KCl+SKA groups; D～F: KCl+SKA+1-Hep groups.

2.4SKA對GJ的影響 給予GJ通道阻滯劑1-Hep，可影響細胞間的聯(lián)系，表現(xiàn)為KCl+1-Hep和KCl+SKA+1-Hep組的熒光強度均明顯降低，KCl+SKA+1-Hep組的熒光強度降低更甚，見表1。我們推測SKA不僅具有穩(wěn)定F-actin結構并抑制其解聚的作用，還可能促進了細胞間的GJ開放，增加了腦細胞間興奮性的傳遞，引發(fā)癲癇的發(fā)作。

表1 SKA對AST細胞F-actin表達的影響

討 論

近年來，星形膠質(zhì)細胞、細胞骨架蛋白與癲癇關系的研究已經(jīng)成為癲癇發(fā)病機制探討的新熱點。細胞骨架蛋白分為微管、微絲和中間絲3種類型。微絲是3種骨架蛋白中最細的1種，在細胞質(zhì)中成束狀平行排列或疏散成網(wǎng)狀，主要由actin組裝而成。而actin以F-actin和球狀肌動蛋白 (G-actin) 形式存在并保持動態(tài)平衡[6]，參與細胞形態(tài)維持及細胞間緊密連接、細胞遷移等[7-8]。此外中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的GJ形成縫隙連接網(wǎng)，傳導電活動，認為與癲癇的形成有關，而actin形態(tài)的完整性是決定GJ功能的基礎[9-12]。

本研究所用SKA的致癇作用、作用機理等均同于KA。由于其結構和谷氨酸類似，可作用于脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Glu受體，既可直接興奮神經(jīng)元，又可增強細胞膜對鈉離子的通透性而使神經(jīng)細胞去極化。實驗以高濃度的KCl作用于培養(yǎng)的AST細胞，模擬神經(jīng)元興奮時的細胞外環(huán)境，觀察不同處理對AST細胞F-actin變化的影響。結果顯示：(1) 高濃度KCl培養(yǎng)條件下，AST細胞F-actin免疫熒光強度比對照組增強，即F-actin含量增加。經(jīng)GJ通道阻滯劑1-Hep作用后，細胞F-actin含量減少，提示F-actin含量變化與GJ之間可能存在某種關聯(lián)，這種關聯(lián)影響了細胞骨架微絲裝配和細胞間信號傳導，推測當神經(jīng)元興奮時，胞外呈高鉀狀態(tài)，細胞骨架actin發(fā)生重構，G-actin向F-actin轉(zhuǎn)化，故F-actin含量增加。(2)高濃度KCl和SKA合用，AST細胞的F-actin免疫熒光強度較單獨KCl組明顯升高，提示SKA可能通過作用于AST細胞膜上的谷氨酸受體，致使細胞去極化，這種去極化狀態(tài)引發(fā)細胞骨架微絲actin的轉(zhuǎn)化或合成，F(xiàn)-actin增多。此結果和Zeng等[13]發(fā)現(xiàn)KA誘發(fā)小鼠癲癇后海馬和大腦皮質(zhì)F-actin相應減少的結果不相一致。(3) 已證明GJ阻滯劑具有抗癲癇作用[14]。本研究使用GJ通道阻滯劑1-Hep，使得SKA所致的F-actin熒光強度明顯降低，推測SKA所致F-actin增多可能和GJ有關，是否SKA誘發(fā)癲癇作用和其引發(fā)GJ開放、促進了細胞間死亡信號的彌散有關[15]；另一方面F-actin熒光強度減少，是否是1-Hep降低GJ通透性或關閉GJ，AST細胞間通訊能力下降，而微絲的變化又與細胞間信息傳導有關，這種信息導致F-actin解聚或向G-actin轉(zhuǎn)化，顯示為F-actin含量減少。

本研究還發(fā)現(xiàn)，KCl+SKA+1-Hep組F-actin形態(tài)的完整性遭到破壞，細胞微絲有斷裂現(xiàn)象(圖3F)，這恰好可從形態(tài)學角度解釋GJ確實出現(xiàn)異常。但F-actin細絲出現(xiàn)整齊的橫斷面的原因還不清楚，這是否與1-Hep的自身特性有關，目前還不得而知。結果可見，加入1-Hep后，SKA組F-actin熒光強度降低，但其F-actin含量并不隨SKA劑量變化而變化，推測原因可能是所選用1-Hep劑量足以阻斷所用SKA劑量范圍內(nèi)所有GJ通道所致。

KA對神經(jīng)元的損害作用已有大量實驗研究，一般認為在使用1～50 μmol/L濃度時，KA對培養(yǎng)的神經(jīng)元已產(chǎn)生神經(jīng)興奮毒性作用，增大到100～500 μmol/L時，開始具有細胞毒性作用，存在劑量依賴性關系[16]。但KA對神經(jīng)膠質(zhì)細胞，尤其是對星形膠質(zhì)細胞的毒性作用報道極少。本實驗結果顯示，SKA的濃度在5～250 μmol/L的范圍均可引起星形膠質(zhì)細胞的F-actin表達增加，但量效關系不甚明顯，其原因有待進一步研究。此外，GJ在癲癇的發(fā)生和持續(xù)中的作用及SAK對GJ的具體影響，值得進一步研究。

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