盧春婷， 李佳縈， 馮 烈△， 宋元宗， 張占會， 盧筱華， 陳纖纖

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1內(nèi)分泌代謝科， 2兒科， 3中心實驗室， 廣東 廣州 510632)

在全球范圍內(nèi)，嬰兒膽汁淤積性黃疸的患病率約為1/2 500[1]。其最常見的病因為膽道閉鎖、感染和遺傳性代謝異常如citrin缺陷病 (citrin deficiency, CD)、半乳糖血癥、糖原累積病等[2]。沒有明確病因的嬰兒膽汁淤積性黃疸被稱為特發(fā)性新生兒膽汁淤積癥(idiopathic neonatal cholestasis, INC)。CD是由編碼citrin蛋白的SLC25A13基因突變所致的一種常染色體隱性遺傳病[3]，目前已在CD患者中發(fā)現(xiàn)81種SLC25A13致病突變類型[4-5]。CD有3種年齡相關(guān)的臨床表型，分別為citrin缺陷導(dǎo)致的新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥(neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency, NICCD)[6]、成人發(fā)病瓜氨酸血癥II型(adult-onset citrullinemia type Ⅱ, CTLN2)[3,7]以及citrin缺陷導(dǎo)致的生長發(fā)育落后和血脂異常(failure to thrive and dyslipidemia caused by citrin deficiency, FTTDCD)[4]。作為CD的主要兒科臨床表型，NICCD在我國并不罕見。分子流行病學(xué)調(diào)查顯示我國人群SLC25A13突變攜帶率為1/63，其中江南地區(qū)高達1/48[8]。NICCD主要在新生兒或嬰兒期發(fā)病，以肝大、黃疸、肝功能異常和低血糖為主要臨床表現(xiàn)[7]。本研究旨在分析NICCD患兒血糖等生化指標及SLC25A13基因突變特點，并探討兩者相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1 對象

2013年3月1日至2013年10月31日在我院以膽汁淤積性肝病臨床表現(xiàn)就診的0～12月齡嬰兒。經(jīng)SLC25A13基因分析確診的NICCD患兒為病例組 (NICCD組)；經(jīng)基因分析排除NICCD診斷且未發(fā)現(xiàn)明確病因的INC患兒為對照組 (INC組)。本研究進行SLC25A13基因突變分析獲得患兒父母書面知情同意。

2 方法

2.1DNA提取及SLC25A13基因診斷 采用DNA抽提試劑盒(Simgen)提取所有研究對象的外周血DNA；DNA marker、普通Tag酶及LA-Taq均購自TaKaRa；引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。PCR反應(yīng)(PTC-200，Life Science Inc.)及凝膠電泳條件(PAC300，Bio-Rad)參考文獻[9-10]。對研究對象進行4種SLC25A13基因高頻突變的篩查[4]，若只發(fā)現(xiàn)一個突變等位基因則進一步對SLC25A13基因的所有18個外顯子及其側(cè)翼序列進行測序。測序反應(yīng)基于Sanger的雙脫氧終止法原理，以PCR引物作為測序引物(BigDye Terminator試劑盒, BI3730測序儀)。由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司廣州分部完成測序反應(yīng)。

2.2生化指標檢測 所有患兒空腹抽取靜脈血，生化實驗室檢查在Hitachi 7600儀器上完成，檢測所有研究對象的血糖和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)，肝酶指標丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase, GGT)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)，血脂指標甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)等數(shù)據(jù)資料。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，AFP及肝酶指標采用中位數(shù) (最小值～最大值) [median (minimum～maximum)]表示。對計量資料采用t檢驗、方差分析或Wilcoxon秩和檢驗進行分析，對計數(shù)資料采用2檢驗進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NICCD血糖及其它生化指標的特點

NICCD組患兒36例，其中男14例，女22例，年齡1～12月。INC組患兒23例，其中男16例，女7例，年齡0.5～12月。如表1所示，分別經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗及t檢驗，兩組間的ALT及LDL-C差異顯著 (P<0.05)。NICCD組血清ALT及LDL-C的中位數(shù)均較INC組低，見圖1。NICCD組血糖均值較INC組低[(5.0±1.2) mmol/Lvs(5.1±1.0) mmol/L]，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 NICCD組與INC組患兒的實驗室指標比較

Figure 1. The serum levels of ALT (A) and LDL-C (B) in the patients with NICCD and INC. ○ and ☆ represent the outlier and extreme value, respectively.NICCD: neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency; INC: idiopathic neonatal cholestasis; ALT: alanine aminotransferase; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol. P<0.05 betweem the 2 groups.

2 SLC25A13基因突變類型在不同性別及年齡段患兒之間的差異

本研究36例NICCD患兒共檢出SLC25A13基因突變10種， 其中851del4、IVS16ins3kb、IVS6+5G>A和1638ins23為高頻突變，分別占全部突變的61%、11%、6%及4%，總和占82%；其余6種分別為IVSins6kb、R360X、C.2T>C、C.415G>A、Q259X和IVS11+1G>A，均為文獻已報道的突變。另有5個等位基因的突變性質(zhì)有待明確。經(jīng)2檢驗，不同性別NICCD患者的SLC25A13基因突變類型分布無不同 (2=2.27，P>0.05)；將NICCD患兒按月齡段分為4組，經(jīng)2檢驗，不同年齡段的NICCD患兒SLC25A13基因突變類型無不同(2=12.03，P>0.05)。

3 SLC25A13基因突變類型與生化指標的關(guān)聯(lián)性

討 論

Citrin由SLC25A13基因編碼，是一種存在于線粒體內(nèi)膜的天冬氨酸/谷氨酸載體蛋白，主要在肝臟表達。Citrin的主要功能是將線粒體內(nèi)天冬氨酸轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)，提供尿素、蛋白及核苷酸的合成原料；同時，將胞質(zhì)的谷氨酸轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)部。以上過程與蘋果酸穿梭相耦聯(lián)，伴隨著胞質(zhì)中的NADH氧化為NAD+，從而維持NADH/NAD+比值的恒定，保持了胞質(zhì)中氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)定性。此外，citrin還參與能量、氨基酸、脂類代謝，并在糖酵解、糖異生代謝途徑中發(fā)揮重要作用。NICCD是嬰幼兒膽汁淤積癥的常見病因，而citrin缺陷所致的生化與代謝異常的具體機制目前尚未十分清楚[11]。

已有研究指出NICCD與低血糖的發(fā)生有關(guān)，有學(xué)者認為這可能與citrin缺陷導(dǎo)致蘋果酸穿梭障礙，導(dǎo)致胞內(nèi)NADH/NAD+比值升高，抑制NADH的氧化磷酸化，致使糖酵解及糖異生受阻有關(guān)[12]。在本研究中，NICCD患兒的血糖均值較INC組低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與國內(nèi)有關(guān)研究結(jié)果不一致[13]。這可能與本研究的對照組為非健康人群，亦可能是由于NICCD組患兒樣本例數(shù)較少所致。有研究顯示，與INC患兒相比，NICCD患兒的血清ALT水平較低[5]，本研究結(jié)果與此一致。本研究發(fā)現(xiàn)NICCD患兒LDL-C水平低于INC組，在國內(nèi)外屬首次報道。LDL-C是富含膽固醇的脂蛋白，主要由肝臟合成，其主要作用是把膽固醇從肝臟運送到全身。NICCD患兒LDL-C的水平低于INC組，考慮是2種疾病的病因與發(fā)病機制不同所致。低LDL-C血癥可能為NICCD患兒血脂紊亂的特點。

表2 SLC25A13基因突變類型與生化指標關(guān)聯(lián)性分析

本研究NICCD患兒中共檢出SLC25A13基因突變10種，其中851del4、IVS16ins3kb、IVS6+5G>A及1638ins23突變占所有突變的82%，為高頻突變。其中，851del4所占比例為61%，是最常見的突變類型。該突變在我國SLC25A13突變攜帶者中占70%[14]；而在患有膽汁淤積性黃疸癥的嬰兒中，該突變攜帶率為1/17，遠遠高于此突變在健康人群中的攜帶率(1/93)[15]。SLC25A13突變與血糖、ALT、AST、ALP、TG、 HDL-C及LDL-C無關(guān)聯(lián)，其原因可能為不同的SLCA25A13基因突變對 citrin 蛋白功能造成的影響程度并無不同，下一步需從蛋白水平證實以上假設(shè)。另外，NICCD 患者基因型與生化表型的關(guān)系，可能存在其它影響因素，如某些未知的修飾基因、飲食因素，或者某種藥物的治療效果等。本研究提示SLC25A13基因突變分布與GGT的水平有關(guān)聯(lián)，但該發(fā)現(xiàn)的意義或價值尚不明確。是否攜帶某種SLC25A13突變基因的患兒其GTT水平較攜帶其它突變的患兒高，有待采取增大樣本量的方式進行深入研究。

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