曾智桓， 趙艷群， 周萬興， 黃瑞邈， 朱桂平， 肖月瓊

(廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)是治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)最有效的手段之一，但術(shù)后3～6個(gè)月內(nèi)原擴(kuò)張部位再狹窄率高達(dá)30%～50%，明顯限制了經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)的臨床療效[1]。進(jìn)一步研究再狹窄的發(fā)病機(jī)制，有效防治經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后再狹窄顯得極為重要。所以首先要建立理想的、合乎臨床多因素致病機(jī)制的血管再狹窄動(dòng)物模型。本研究通過下肢動(dòng)脈穿刺與球囊損傷、球囊血管成形術(shù)結(jié)合，成功建立兔動(dòng)脈粥樣硬化血管成形術(shù)后再狹窄模型，方法簡(jiǎn)單，成功率高，可重復(fù)性強(qiáng)，為臨床研究和治療提供了可靠的疾病模型。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

雄性新西蘭大白兔30只，體質(zhì)量(1.86±0.65) kg，由廣東省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)為0064167)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即對(duì)照組、下肢動(dòng)脈穿刺組及下肢動(dòng)脈切開組。實(shí)驗(yàn)在中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心及廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院導(dǎo)管室完成。

2 主要儀器及設(shè)備

TERUMO 橈動(dòng)脈穿刺包(包括穿刺套管針、細(xì)超滑鋼絲和6F橈動(dòng)脈鞘)為日本泰爾茂株式會(huì)社生產(chǎn)；碘海醇注射液(歐乃派克350注射液)為通用電氣藥業(yè)上海有限公司生產(chǎn)；經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)球囊FireStar 3.0 mm×20 mm為美國強(qiáng)生公司生產(chǎn)；HITACHI 7180全自動(dòng)生化分析儀；V5000數(shù)字減影X射線機(jī)(Philips)；CREALIFE ST-CRS思創(chuàng)科技圖像工作站。

3 模型制備方法

3組家兔均用高脂飼料喂養(yǎng)1周，除對(duì)照組外，其它2組家兔均采用氯胺酮(25 mg/kg)+地西泮(0.11 mg/kg)腿部肌肉注射麻醉，仰臥位固定，下肢備皮。下肢動(dòng)脈穿刺組采用TERUMO橈動(dòng)脈穿刺包穿透法穿刺股動(dòng)脈成功后輕柔地進(jìn)入導(dǎo)絲，沿導(dǎo)引鋼絲插入6F橈動(dòng)脈鞘管，300 U肝素抗凝，在數(shù)字減影X射線機(jī)下，經(jīng)動(dòng)脈鞘管注入碘海醇注射液行動(dòng)脈造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm 經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)球囊至髂動(dòng)脈，用303.975 kPa充盈球囊，在髂動(dòng)脈上下牽拉3次，充分剝離髂動(dòng)脈內(nèi)皮。傷口紗布卷加壓包扎。下肢動(dòng)脈切開組，在右大腿中部沿股動(dòng)脈走行切開皮膚，分離皮下組織及右側(cè)股動(dòng)脈，結(jié)扎動(dòng)脈遠(yuǎn)端，阻斷動(dòng)脈近端，縱行切開動(dòng)脈壁，插入TERUMO橈動(dòng)脈鞘，300 U 肝素抗凝，經(jīng)動(dòng)脈鞘管注入碘海醇注射液行動(dòng)脈造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)球囊至髂動(dòng)脈，用303.975 kPa充盈球囊，在髂動(dòng)脈上下牽拉3次，充分剝離髂動(dòng)脈內(nèi)皮。拔出鞘管，結(jié)扎動(dòng)脈近端。縫合傷口皮膚，無菌敷料覆蓋。2組均肌肉注射青霉素鈉(8.0×105U/d)×3 d。3組動(dòng)物繼續(xù)高脂飼養(yǎng)4周。

高脂飼養(yǎng)4周后，下肢動(dòng)脈穿刺組及下肢動(dòng)脈切開組的家兔再次采用上述方法麻醉、固定。下肢動(dòng)脈穿刺組下肢備皮，采用TERUMO橈動(dòng)脈穿刺包穿透法穿刺股動(dòng)脈成功后輕柔地進(jìn)入導(dǎo)絲，沿導(dǎo)引鋼絲插入6F橈動(dòng)脈鞘管，300 U肝素抗凝，在數(shù)字減影X射線機(jī)下，經(jīng)動(dòng)脈鞘管注入碘海醇注射液行動(dòng)脈造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm 經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)球囊至髂動(dòng)脈損傷處，用607.95 kPa充盈球囊擴(kuò)張髂動(dòng)脈損傷處，每次擴(kuò)張30 s，擴(kuò)張3次。下肢動(dòng)脈切開組右頸動(dòng)脈區(qū)域備皮，沿頸動(dòng)脈走行切開皮膚，分離皮下組織及右側(cè)頸動(dòng)脈，結(jié)扎動(dòng)脈遠(yuǎn)端，阻斷動(dòng)脈近端，縱行切開動(dòng)脈壁，插入TERUMO橈動(dòng)脈鞘，300 U 肝素抗凝，經(jīng)動(dòng)脈鞘管注入碘海醇注射液行動(dòng)脈造影。再沿鞘送入FireStar 3.0 mm×20 mm 經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)球囊至右髂動(dòng)脈，用607.95 kPa充盈球囊擴(kuò)張髂動(dòng)脈損傷處，每次擴(kuò)張30 s，擴(kuò)張3次。3組動(dòng)物均改為普通飼料喂養(yǎng)4周。最后再采用上述方法麻醉、固定及穿刺股動(dòng)脈造影，采動(dòng)脈血檢測(cè)血脂，取髂動(dòng)脈。

4 觀察指標(biāo)及方法

各組血清標(biāo)本均采用HITACHI 7180全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇和三酰甘油濃度。髂動(dòng)脈標(biāo)本取材后立即用體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液固定1 d后脫水，石蠟包埋，連續(xù)病理切片2張(厚4.0～5.0 μm)，行蘇木精-伊紅和免疫組化染色。各組造影結(jié)果采用CREALIFE ST-CRS思創(chuàng)科技圖像工作站進(jìn)行血管狹窄分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)先行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)；兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn);兩組以上均數(shù)比較在方差齊時(shí)用單因素方差分析，方差不齊時(shí)用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物一般情況

下肢動(dòng)脈切開組1只實(shí)驗(yàn)兔第2次實(shí)驗(yàn)術(shù)后1周因感染、腹瀉死亡，對(duì)照組及動(dòng)脈穿刺組均順利完成實(shí)驗(yàn)進(jìn)入結(jié)果分析，成功率100%。所有實(shí)驗(yàn)兔均未見肢體缺血壞死，但下肢動(dòng)脈切開組右下肢動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后行動(dòng)明顯遲緩，進(jìn)食量下降，精神狀態(tài)差。

2 3組家兔的血脂水平比較

血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇在動(dòng)脈切開組均較動(dòng)脈穿刺組及模型對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白膽固醇在3組間無顯著差別(P>0.05)。

表1 血清三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白膽固醇的檢測(cè)結(jié)果

3 病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組可見粥樣斑塊，動(dòng)脈壁及內(nèi)膜略增厚，中膜平滑肌少量泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞形成(圖1A)；動(dòng)脈穿刺組(圖1B)及動(dòng)脈切開組(圖1C)均可見明顯粥樣斑塊，動(dòng)脈壁增厚，管腔狹窄，層次不清，內(nèi)膜增厚，中膜平滑肌增生紊亂，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，形成典型的“纖維帽”結(jié)構(gòu)，尤其是動(dòng)脈穿刺組，部分斑塊內(nèi)出現(xiàn)鈣化或大量纖維化。

Figure 1. Iliac artery in the rabbits with different treatments (hematoxylin-eosin staining, ×100).A:control group; B:arterial puncture group; C:limb artery incision group.

4 血管造影血管狹窄分析

與對(duì)照組相比，動(dòng)脈穿刺組與動(dòng)脈切開組均形成顯著血管再狹窄，見圖2。與對(duì)照組相比，動(dòng)脈穿刺組與動(dòng)脈切開組血管面積狹窄率及直徑狹窄率均有顯著差異(P<0.01)；動(dòng)脈穿刺組面積狹窄率及直徑狹窄率均較動(dòng)脈切開組稍高，但尚未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與樣本量較小有關(guān),見表2。

Figure 2. Iliac artery stenosis in the rabbits with different treatments (angiography, ×3).A:control group; B: arterial puncture group; C:limb artery incision group.

表2 對(duì)照組、動(dòng)脈穿刺組和動(dòng)脈切開組家兔髂動(dòng)脈再狹窄的比較

討 論

如何建立有效的血管再狹窄模型對(duì)開展血管成形術(shù)后再狹窄(restenosis after angioplasty)的研究非常重要[2]。國內(nèi)外用于血管再狹窄研究的動(dòng)物模型的建立方法眾多，主要選擇的動(dòng)物有大鼠、兔、豬、犬等，選取的手術(shù)部位也多種多樣[3]。新西蘭兔建模穩(wěn)定，成本較低，為最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[4]。兔的髂動(dòng)脈管腔大小更接近人的冠狀動(dòng)脈再狹窄, 故本實(shí)驗(yàn)選用該動(dòng)脈。

兔血管再狹窄模型建模方法多采用切開、結(jié)扎股動(dòng)脈或頸動(dòng)脈，球囊損傷加高脂喂養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上行球囊擴(kuò)張建立再狹窄模型，由于切開、動(dòng)脈結(jié)扎的技術(shù)問題，以及時(shí)常造成傷口感染，動(dòng)物肢體缺血，活動(dòng)能力差，進(jìn)食少，經(jīng)常發(fā)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況[5]。本實(shí)驗(yàn)切開組出現(xiàn)1只動(dòng)物死亡，進(jìn)食量明顯下降，最后化驗(yàn)血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇較對(duì)照組低，也證實(shí)了這一點(diǎn)。而采用經(jīng)皮動(dòng)脈穿刺，術(shù)后局部加壓包扎止血即可，無明顯手術(shù)傷口，有利于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后的恢復(fù)。

傳統(tǒng)的兔動(dòng)脈粥樣硬化及再狹窄模型均采用切開后結(jié)扎方法，動(dòng)脈結(jié)扎后形成盲端，血流顯著減慢，部分可能無血流，與臨床所見再狹窄形成過程中血流動(dòng)力學(xué)不一致，造成血管內(nèi)膜增生和血管向內(nèi)重塑反應(yīng)不同，可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差[6]。

目前尚沒有關(guān)于經(jīng)皮穿刺兔血管制作血管再狹窄模型的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過多次穿刺兔股動(dòng)脈，對(duì)兔髂動(dòng)脈進(jìn)行球囊損傷，建立兔血管狹窄的病理模型，再對(duì)病變血管進(jìn)行球囊擴(kuò)張成形術(shù)，形成再狹窄模型，可對(duì)血管再狹窄疾病發(fā)生發(fā)展的過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察和評(píng)價(jià)。但經(jīng)皮穿刺兔股動(dòng)脈要求術(shù)者要有良好的血管穿刺基礎(chǔ)，在日常工作中如果能熟練地進(jìn)行橈動(dòng)脈穿刺者，穿刺成功率將大大提高。建議使用套管針穿刺，盡可能一次穿刺成功，否則局部血腫將嚴(yán)重影響再次穿刺。一旦發(fā)生，可局部壓迫止血，選擇對(duì)側(cè)股動(dòng)脈穿刺。本實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)了多次兔股動(dòng)脈經(jīng)皮穿刺的可行性，無需反復(fù)結(jié)扎動(dòng)脈，為兔血管成形術(shù)后再狹窄提供了新的研究方法。

本文為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，動(dòng)脈粥樣硬化形成迅速，與人類的冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后再狹窄仍存在一定的差異。但由于本實(shí)驗(yàn)方法有模型穩(wěn)定可靠、易于復(fù)制、成功率高等優(yōu)點(diǎn)，而且證實(shí)了在血管再狹窄機(jī)制方面均存在血管內(nèi)膜增生、平滑肌細(xì)胞增殖、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、斑塊內(nèi)部鈣化或大量纖維化等機(jī)制，與臨床再狹窄相似，是血管成形術(shù)后再狹窄研究中較理想的動(dòng)物模型，值得進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Togni M,Windecker S,Cocchia R,et al.Sirolimus-eluting stents associated with paradoxic coronary vasoconstriction[J].J Am Coll Cardiol, 2005, 46(2):231-236.

[2] Suzuki Y, Yeung AC, Ikeno F.The pre-clinical animal model in the translational research of interventional car-diology[J].JACC Cardiovasc Interv, 2009, 2(5):373-383.

[3] Touchard AG, Schwartz RS.Preclinical restenosis models: challenges and successes[J]. Toxicol Pathol, 2006, 34(1):11-18.

[4] Langeveld B, Van Gilst WH, Zijlstra F. A simple, inexpensive, rapid, and accurate preclinical model for in-stent restenosis[J]. J Am Coll Cardiol, 2005, 45(8):1310-1311.

[5] Knopfholz J, Précoma DB, Brofman PR,et al.The effect of L-arginine on neointimal proliferation and artery remo-deling on an iliac artery lesion caused by a balloon catheter in hypercholesterolemic rabbits[J]. Arq Bras Cardiol, 2006, 87(4):520-524.

[6] Paszkowiak JJ, Maloney SP, Kudo FA,et al.Evidence supporting changes in Nogo-B levels as a marker of neoin-timal expansion but not adaptive arterial remodeling[J]. Vascul Pharmacol, 2007, 46(4):293-301.