陳 燕， 杜艷偉， 王曉琴， 付 雙， 劉蓮勤， 于 淇， 方 圓， 高 品， 楊 光， 孟 艷， 趙雪儉△

(吉林大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2第一醫(yī)院腎病科，吉林 長春 130021)

內(nèi)毒素血癥誘發(fā)的失控性全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是導(dǎo)致多器官功能衰竭的重要原因，而急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是其中最嚴(yán)重的并發(fā)癥，致死率極高[1]。Annane[2]認(rèn)為膿毒癥誘發(fā)的SIRS中，致炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α)等釋放又可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞進(jìn)一步激活形成炎癥因子“瀑布”反應(yīng)，患者處于危急狀態(tài)時(shí)外源性糖皮質(zhì)激素能逆轉(zhuǎn)這種狀態(tài)，使心血管系統(tǒng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，各器官的功能恢復(fù)，從而挽救了患者的生命。2013年Choi等[3]認(rèn)為糖皮質(zhì)激素可通過減輕線粒體損傷和凋亡，起到治療膿毒性AKI的作用。實(shí)際上，糖皮質(zhì)激素?fù)尵任０Y和多種難治性疾病的功能很強(qiáng)大。盡管如此，糖皮質(zhì)激素的副作用不容忽視, 譬如，胃腸道應(yīng)激性出血可成為各種危癥患者的隱形殺手[4]。此外，肥胖、骨質(zhì)疏松癥和胰島素抵抗等副作用難以防治[5]。因此，臨床急需有與糖皮質(zhì)激素類似療效的而無糖皮質(zhì)激素樣副作用的藥物。自古以來，人參湯有 “起死回生”之功效。為用現(xiàn)代技術(shù)揭示其中的奧秘，本研究組通過系列研究發(fā)現(xiàn)，人參二醇組皂苷(panaxadiol saponins，PDS)有地塞米松(dexamethasone, DEX)相類似的改善失血性休克犬心肺微循環(huán)、逆轉(zhuǎn)心肺功能等作用[6]。而且，PDS沒有DEX相類似的副作用。然而，PDS是否同DEX一樣能夠減輕膿毒癥誘導(dǎo)的AKI,尚缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)。因此，本研究擬在建立LPS誘導(dǎo)的AKI小鼠模型的基礎(chǔ)上，對(duì)比研究PDS和DEX對(duì)LPS誘導(dǎo)的AKI的影響及其分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 小鼠AKI模型復(fù)制與分組

C57BL/6小鼠隨機(jī)分為鹽水對(duì)照(control)組、LPS模型組(LPS組)、PDS+LPS組和DEX+LPS組(共計(jì)32只，n=8)。對(duì)照組經(jīng)腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.5 mL，其余3組分別經(jīng)腹腔注射LPS 10 mg/kg。PDS+LPS組、DEX+LPS組小鼠在LPS注射前1 h分別經(jīng)腹腔注射PDS(25.0 mg/kg)或DEX(2.5 mg/kg)。LPS處理12 h后，麻醉下取腎臟組織凍存或固定，備蛋白檢測與形態(tài)學(xué)觀察；采集血液，血液在室溫下離心(3 000 r/min)10 min制備血清樣本, 應(yīng)用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測小鼠血清肌酐(creatinine， CREA)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的含量。

2 酶聯(lián)免疫法檢測血清TNF-α和IL-6含量

取小鼠血清，用酶聯(lián)免疫法(試劑盒購自上?？泼羯锛夹g(shù)有限公司)測定血清TNF-α和IL-6的水平。酶標(biāo)儀為Bio-Tek，型號(hào)ELX800。TNF-α和IL-6的血清濃度用ng/L表示。

3 應(yīng)用免疫印跡(Western blotting)檢測蛋白的表達(dá)

3.1腎組織蛋白提取 總蛋白、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的提取：將100 mg腎組織用液氮研磨成粉末，并移至EP管中，再加入500～800 μL組織裂解液RIPA(含PMSF和蛋白酶抑制劑)于冰上孵育10 min，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min，離心20 min。吸取上清分裝，保存于-80 ℃。細(xì)胞核蛋白(n-pro)與細(xì)胞漿蛋白(c-pro)的提?。喊碞E-PER核蛋白-胞漿蛋白提取試劑盒(Thermo Scientific Pierce)的說明書操作，分別提取出這2種蛋白。

3.2免疫印跡法檢測 胞質(zhì)和胞核提取物及總蛋白濃度通過BCA法測定。按常規(guī)方法配制聚丙烯酰胺凝膠，依次進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、ECL顯色?？贵w包括錳超氧化物歧化酶(manganese superoxid dismutase,Mn-SOD)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、糖皮質(zhì)激素受體(glycocorticoid receptor,GR)、p-IκB、IκB、p50、p65、lamin B1 (Abcam)和β-actin (Proteintech Group)。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔IgG Ⅱ抗購自Proteintech Group(稀釋度為1∶10 000)。

3.3結(jié)果分析 特異性條帶的表達(dá)豐度用上海天能科技有限公司GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描。以β-actin或Lamin B1 作為內(nèi)參照，各蛋白表達(dá)水平的組間比較用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。

4 腎組織一氧化氮(nitric oxide，NO)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的檢測

腎組織NO含量檢測，采用硝酸還原酶法測定；腎組織MDA檢測，應(yīng)用硫代巴比妥酸法。所用檢測試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM) 表示。組間差異采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS 成功建立AKI小鼠模型，PDS和DEX均能減輕LPS誘導(dǎo)的AKI

LPS 組腎臟指數(shù)明顯增加，LPS組腎臟相對(duì)重量(0.0073±0.0004)顯著高于對(duì)照組(0.0056±0.0005)(P<0.01)。然而, PDS和DEX組腎臟相對(duì)重量 (0.0064±0.0001和0.0065±0.0001)明顯低于LPS組(P<0.05)。

BUN含量 LPS組為(32.31±1.76) mmol/L，對(duì)照組為(11.83±0.99)mmol/L，LPS組顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。然而，PDS+LPS組的BUN含量為(24.95±2.61)mmol/L，與DEX+LPS組的BUN含量[(24.90±2.41) mmol/L]接近，均顯著低于LPS組(P<0.05)。 血清CREA含量，LPS組為最高[(44.15±2.87)μmol/L],與對(duì)照組[(16.16±1.43)μmol/L]比較差異顯著(P<0.01)；PDS+LPS組[(32.60±2.80)μmol/L]和DEX+LPS組[(31.77±4.60)μmol/L]接近，均明顯低于LPS組(P<0.05)，見表1。這些結(jié)果表明腹腔注射10 mg/kg LPS，12 h后能成功復(fù)制LPS誘導(dǎo)的AKI小鼠早期動(dòng)物模型，并且PDS具有與DEX相類似的改善AKI小鼠腎功能的效應(yīng)。

表1 PDS對(duì)LPS所致急性腎損傷小鼠腎臟指數(shù)、血清CREA和BUN的影響

2 PDS和DEX改善LPS誘導(dǎo)的AKI小鼠腎功能的作用機(jī)制

2.1PDS和DEX均能抑制LPS誘導(dǎo)AKI小鼠TNF-α和IL-6的產(chǎn)生 如圖1所示，LPS組血清TNF-α和IL-6含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)。PDS組TNF-α和IL-6含量明顯低于LPS組(P<0.05)，DEX組與LPS組比較，TNF-α有下降趨勢，IL-6顯著降低(P<0.05)。

Figure 1. PDS and DEX inhibited TNF-α (A) and IL-6 (B) production in LPS-induced AKI mice. Mean±SEM. n=8.*P<0.05, **P<0.01 vs control；#P<0.05 vs LPS.

2.2PDS和DEX均能抑制LPS誘導(dǎo)AKI小鼠NF-κB信號(hào)通路的活化 如圖2 所示，LPS組磷酸化IκB(p-IκB)蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較明顯增高(P<0.01)，PDS組p-IκB蛋白表達(dá)水平明顯低于LPS組(P<0.05)，DEX組的p-IκB表達(dá)水平與LPS組比較也有降低趨勢。 LPS組的核NF-κB p65和p50的表達(dá)水平與對(duì)照組比較顯著增高(P<0.05)。然而，與LPS組比較，PDS組和DEX組核內(nèi)NF-κB p65和p50表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)?？梢姡琍DS和DEX抑制了IκB蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而抑制了NF-κB信號(hào)通路活化，減少炎癥因子產(chǎn)生與釋放，逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)AKI的腎功能。

2.3PDS和DEX均能抑制LPS處理小鼠腎臟iNOS的表達(dá)和NO含量的升高 LPS組腎臟組織iNOS蛋白表達(dá)水平和NO含量與對(duì)照組比較均顯著增高(P<0.05)。然而，PDS組和DEX組腎臟組織iNOS蛋白表達(dá)水平和NO含量均顯著低于LPS組(P<0.05)，見圖3。

Figure 2. PDS and DEX suppressed NF-kappa B signaling pathway activation in the kidney of LPS-induced AKI mice.Mean±SEM. n=8.*P<0.05 vs control； #P<0.05 vs LPS.

Figure 3. PDS and DEX reduced renal nitric oxide (NO) production (A) and inducible notric oxide snythase (iNOS) expression (B) in LPS-treated mice.Mean±SEM. n=8.**P<0.01 vs control； #P<0.05 vs LPS.

2.4PDS和DEX均能降低LPS處理小鼠腎臟MDA的含量，上調(diào)腎組織Mn-SOD蛋白的表達(dá) LPS組腎組織MDA含量與對(duì)照組比較明顯增高(P<0.05),而清除氧自由基酶Mn-SOD的蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，見圖4。LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激加重AKI小鼠的腎臟功能障礙。然而，PDS和DEX則通過抗氧化應(yīng)激作用減輕LPS誘導(dǎo)的AKI。

Figure 4. PDS and DEX up-regulated renal Mn-SOD expression (B) and decreased MDA content (A) in LPS-treated mice.Mean±SEM. n=8.*P<0.05, **P<0.01 vs control； #P<0.05 vs LPS.

3 PDS與DEX均能增加LPS處理小鼠腎臟細(xì)胞核GR(nuclear GR, n-GR)的含量

總GR(total GR，t-GR)除對(duì)照組表達(dá)最低，其余3組t-GR表達(dá)水平均明顯增高，組間沒有顯著差異。LPS組n-GR水平與對(duì)照組比較明顯降低(P<0.05)，PDS+LPS組和DEX+LPS組n-GR表達(dá)水平相似，均明顯高于LPS組(P<0.05)，見圖5。這些結(jié)果提示，PDS有可能是GR的功能配體。

Figure 5. PDS and DEX increased nuclear glucocorticoid receptor (n-GR) content in the kidney from LPS-treated mice. Mean±SEM. n=8.*P<0.05 vs control；#P<0.05 vs LPS.

討 論

膿毒癥誘發(fā)的失控性SIRS是導(dǎo)致多器官功能衰竭的重要原因，AKI是其中最嚴(yán)重的并發(fā)癥，致死率極高[7]。本研究組用LPS 10 mg/kg腹腔注射，12 h已經(jīng)成功地用LPS誘導(dǎo)出早期AKI小鼠模型。LPS組血清BUN含量顯著高于對(duì)照組；血清肌酐含量LPS組同樣顯著高于對(duì)照組。重要的是，PDS和DEX均能明顯地改善LPS誘導(dǎo)AKI小鼠的腎功能，這些結(jié)果顯示PDS預(yù)處理具有DEX相似的效果，均能減輕LPS誘導(dǎo)的AKI。為探討PDS和DEX減輕LPS誘導(dǎo)的AKI的機(jī)制， 我們進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

AKI的發(fā)病源于對(duì)促炎因子的反應(yīng)，包括細(xì)胞因子分泌和活性氮氧自由基的作用[8]。譬如，TNF-α不僅僅是具有殺滅腫瘤細(xì)胞作用的細(xì)胞因子，而且，TNF-α與2個(gè)不同的受體結(jié)合，能激活不同的和重疊的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。血管內(nèi)皮細(xì)胞受TNF-α攻擊后，通過接受大量的促炎信號(hào),可增加白細(xì)胞黏附、血管滲漏和血栓形成等。因此，TNF在炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS組血清TNF-α和IL-6 含量與對(duì)照組比較明顯升高。而PDS和DEX均明顯抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α 和IL-6的產(chǎn)生。

SIRS的發(fā)生與NF-κB信號(hào)通路的活化相關(guān)。在靜息時(shí)抑制性蛋白IκB 與NF-κB以二聚體的形式結(jié)合，以無活性的形式存在于胞漿中。然而，當(dāng)細(xì)胞接受TNF-α等炎癥因子刺激時(shí)，會(huì)激活I(lǐng)κB激酶[9]，促使IκB磷酸化，導(dǎo)致IκB發(fā)生泛素化和蛋白酶體降解，從而釋放NF-κB，使其解離成p65和p50 轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因產(chǎn)生與釋放炎癥因子，誘發(fā)失控性SIRS，進(jìn)而導(dǎo)致多器官功能損傷。本研究結(jié)果表明，LPS組p-IκB蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較明顯增高(P<0.01)，必然促進(jìn)NF-κB的釋放，核p65和p50的蛋白表達(dá)LPS組明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。p50和p65啟動(dòng)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生與釋放，進(jìn)而加重LPS誘導(dǎo)的AKI的腎功能損傷。而PDS+LPS組p-IκB蛋白表達(dá)水平明顯低于LPS組(P<0.05)，DEX組的p-IκB表達(dá)水平與LPS組比較也有降低趨勢。而且，與LPS組比較，PDS組和DEX組核內(nèi)NF-κB p65和p50表達(dá)水平顯著下調(diào)。可見，PDS和DEX均能抑制腎臟組織IκB蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制腎臟NF-κB信號(hào)通路的活化。

本研究還發(fā)現(xiàn)， PDS和DEX均能下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠腎組織iNOS表達(dá)， 并上調(diào)Mn-SOD蛋白表達(dá)。Holthoff等[11]研究表明，白藜蘆醇通過抑制活性氮自由基的活性實(shí)現(xiàn)了減輕膿毒癥性AKI的作用。Wu等[12]研究顯示選擇性iNOS抑制劑L-N6-(1-iminoethyl)-lysine減輕了腎小管的氧化應(yīng)激，并糾正了微循環(huán)的異常。本研究發(fā)現(xiàn)PDS和DEX有同樣的下調(diào)LPS誘導(dǎo)的AKI小鼠腎臟iNOS和NO含量的作用。Kruzel等[13]研究顯示，LPS誘導(dǎo)的氧爆發(fā)起源于線粒體，ROS是從呼吸鏈的復(fù)合體Ⅲ中釋放的。有研究發(fā)現(xiàn)人參二醇組皂苷Rb1(含4個(gè)葡萄糖)可以直接與羥自由基(OH· )相互作用，保護(hù)局部缺血神經(jīng)元[14]。本研究表明在LPS組線粒體特異的捕捉氧自由基的酶Mn-SOD表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯降低。然而，PDS+LPS組和DEX+LPS組的Mn-SOD蛋白表達(dá)水平與LPS組比較被明顯上調(diào)。可見，PDS和DEX均能抑制氧化應(yīng)激減輕LPS誘導(dǎo)的AKI。

眾所周知， DEX通過GR發(fā)揮功能作用。DEX作為配體與GR結(jié)合導(dǎo)致GR活化,活化的GR以同源二聚體形式轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，再與正調(diào)節(jié)的GRE結(jié)合后,能夠誘導(dǎo)一些抗炎蛋白等表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn) PDS與DEX十分相似， 均能增加腎臟組織細(xì)胞n-GR蛋白的含量。然而，PDS是否與DEX一樣也會(huì)作為功能配體與GR結(jié)合導(dǎo)致GR活化 ，以配體-GR復(fù)合物的形式轉(zhuǎn)入細(xì)胞核并能誘導(dǎo)GR的轉(zhuǎn)錄活性呢？我們的分析認(rèn)為，PDS作為GR的功能配體可能性較大，PDS由Rb1、Rb2、Rc和Rd等組成，都在同一位置上含有糖鏈，在酸性環(huán)境下糖鏈被水解掉就會(huì)與受體相互作用，發(fā)揮甾醇的多種生理功能。Lee等[15]已經(jīng)證明人參單體Rg1是核內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體的功能性配體。另一種可能就是PDS可能作為一種激活劑促進(jìn)糖皮質(zhì)激素與GR結(jié)合，然后，以二聚體形式入核發(fā)揮作用。

(致謝：人參二醇組皂苷由吉林大學(xué)天然藥物研究室提供，是從人參莖葉中提取的專利產(chǎn)品，專利號(hào)： ZL 98 1 00070.3。發(fā)明人：馬興元、陳燕萍等。專利權(quán)人：吉林大學(xué)。)

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Venkatachalam MA, Weinberg JM. The tubule pathology of septic acute kidney injury: a neglected area of research comes of age[J]. Kidney Int,2012,81(4):338-340.

[2] Annane D. Corticosteroids for severe sepsis: an evidence-based guide for physicians[J]. Ann Intensive Care, 2011,1(1):7.

[3] Choi HM, Jo SK, Kim SH, et al. Glucocorticoids attenuate septic acute kidney injury[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013,435(4):678-684.

[4] 徐 琳，趙雪儉，趙 丹，等. 人參二醇皂甙對(duì)失血性休克犬單胺類遞質(zhì)和單胺氧化酶的影響[J]. 中國病理生理雜志,1990，6(2):69-72.

[5] Brennan-Speranza TC, Henneicke H, Gasparini SJ, et al. Osteoblasts mediate the adverse effects of glucocorticoids on fuel metabolism[J]. J Clin Invest, 2012,122(11):4172-4189.

[6] 劉喜春，李 璐，于振香，等. 人參二醇皂苷對(duì)LPS休克大鼠肺組織AQP1表達(dá)的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2006，22(8):1562-1565.

[7] Venkatachalam MA, Weinberg JM. The tubule pathology of septic acute kidney injury: a neglected area of research comes of age[J]. Kidney Int, 2012,81(4):338-340.

[8] Wu L, Mayeux PR. Effects of the inducible nitric-oxide synthase inhibitor L-N6-(1-iminoethyl)-lysine on microcirculation and reactive nitrogen species generation in the kidney following lipopolysaccharide administration in mice[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2007,320(3):1061-1067.

[9] Bradley JR. TNF-mediated inflammatory disease[J]. J Pathol, 2008,214(2):149-160.

[10] Naito M, Bomsztyk K, Zager RA. Endotoxin mediates recruitment of RNA polymerase II to target genes in acute renal failure[J]. J Am Soc Nephrol,2008, 19(7):1321-1330.

[11] Holthoff JH, Woodling KA, Doerge DR, et al. Resveratrol, a dietary polyphenolic phytoalexin, is a functional scavenger of peroxynitrite[J]. Biochem Pharmacol, 2010,80(8):1260-1265.

[12] Wu L, Gokden N, Mayeux PR. Evidence for the role of reactive nitrogen species in polymicrobial sepsis-induced renal peritubular capillary dysfunction and tubular injury[J]. J Am Soc Nephrol, 2007,18(6):1807-1815.

[13] Kruzel ML, Actor JK, Radak Z, et al. Lactoferrin decreases LPS-induced mitochondrial dysfunction in cultured cells and in animal endotoxemia model[J]. Innate Immun, 2010,16(2):67-79.

[14] Lim JH, Wen TC, Matsuda S, et al. Protection of ischemic hippocampal neurons by ginsenoside Rb1, a main ingredient of ginseng root[J]. Neurosci Res, 1997,28(3):191-200.

[15] Lee YJ, Chung E, Lee KY, et al. Ginsenoside-Rg1, one of the major active molecules from Panax ginseng, is a functional ligand of glucocorticoid receptor[J]. Mol Cell Endocrinol, 1997,133(2):135-140.