王金艷， 陳 紅， 丁文飛， 鐘愛(ài)民

(江西省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，江西 南昌 330006)

雖然臨床上使用的造影劑不斷改良，但隨著醫(yī)學(xué)影像學(xué)和介入診療技術(shù)的發(fā)展，因診療需要造影劑的使用日益增多，造影劑腎病(contrast-induced nephropathy，CIN)已成為臨床工作中不可忽視的問(wèn)題，尤其有心腦血管疾患的高齡患者或有慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)基礎(chǔ)的患者，CIN的發(fā)生率更高，除了延長(zhǎng)患者住院時(shí)間、增加醫(yī)療費(fèi)用外，部分患者會(huì)出現(xiàn)不可逆的腎功能丟失，致使患者進(jìn)入透析期和死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[1]。近年來(lái)大多數(shù)研究主要是針對(duì)造影劑導(dǎo)致腎臟內(nèi)局灶缺血為主的血流動(dòng)力學(xué)改變、氧自由基清除、造影劑本身對(duì)腎小管細(xì)胞的毒性作用等方面進(jìn)行了機(jī)制方面的研究。CIN的發(fā)病中是否存在炎癥反應(yīng)機(jī)制，國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)導(dǎo)，國(guó)外這方面的研究新近才見(jiàn)少量報(bào)道[2]。本研究著眼于炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)與核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)在CIN模型動(dòng)物腎組織中的表達(dá)，觀察TNF-α、NF-κB與腎損傷分子1(kidney injury molecule-1,KIM-1)之間的關(guān)系，旨在探討CIN發(fā)病中是否存在炎癥反應(yīng)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SD雄性大鼠96只，體重約為250～350 g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 主要試劑

兔抗大鼠NF-κB抗體、KIM-1抗體和TNF-α抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組化SP系列試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)：RT-PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，76%復(fù)方泛影葡胺注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。

3 主要方法

3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 96只雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成2組：對(duì)照組(n=48)和模型組(n=48)，分別從尾靜脈注射76%復(fù)方泛影葡胺注射液(模型組)和生理鹽水(對(duì)照組)10 mL/kg，注射前12 h禁水、禁食。

3.2標(biāo)本采集 造膜前尾靜脈采血2 mL，分別于造模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、10 d和15 d予10%的水合氯醛麻醉大鼠各6只，打開(kāi)腹腔，留取腹主動(dòng)脈血液5 mL做生化檢測(cè)，后取下雙腎，一側(cè)腎臟縱行切開(kāi)，置于10%甲醛液浸泡固定，待用于病理和免疫組化檢測(cè)，另一側(cè)腎組織在剪碎以后置于樣本保存液中，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，留做RT-PCR用。

3.3腎小管間質(zhì)損傷病理評(píng)分(HE染色) 取腎組織行常規(guī)脫水和石蠟包埋，制作成3 μm切片，常規(guī)HE染色，觀察腎間質(zhì)充血、出血，腎小管腫脹、變性、壞死、萎縮，間質(zhì)炎癥細(xì)胞的情況，進(jìn)行腎臟病理評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腎小管：0分為無(wú)腎小管損傷；1分為腎小管損傷范圍<25%；2分為腎小管損傷范圍25%～50%；3分為腎小管損傷范圍51%～75%；4分為腎小管損傷范圍>76%；腎間質(zhì)：0分為無(wú)間質(zhì)充血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；1分為有間質(zhì)充血；1分為有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；1分為有纖維化形成。取其均值作為該標(biāo)本的統(tǒng)計(jì)數(shù)值。

3.4免疫組化染色 取腎組織行常規(guī)脫水和石蠟包埋，制作成3 μm切片，免疫組化SP法檢測(cè)KIM-1、TNF-α和NF-κB的表達(dá)，嚴(yán)格按免疫組化SP系列試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，光鏡下(×400)觀察組織的陽(yáng)性表達(dá)；并采用Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析軟件分析陽(yáng)性目標(biāo)平均光密度進(jìn)行半定量分析，取均值做統(tǒng)計(jì)比較。

3.5RT-PCR檢測(cè) KIM-1、NF-κB、TNF-α以及內(nèi)參照引物合成見(jiàn)表1。(1)采用Trizol一步法提取腎臟組織的RNA；(2)RT-PCR反應(yīng)：按照RT試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，所得的cDNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?3)PCR反應(yīng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以所得的cDNA產(chǎn)物2 μL為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 s，55 ℃ (KIM-1)、58 ℃(NF-κB)或53 ℃ (TNF-α)退火30 s,72 ℃延伸30 s(35、35或30個(gè)循環(huán)),最后72 ℃ 10 min；(4)反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)及Quantity One凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，通過(guò)計(jì)算目的基因PCR產(chǎn)物積分吸光度與β-actin積分吸光度的比值來(lái)反映該目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，取均值做統(tǒng)計(jì)比較。

表1 引物序列

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血清肌酐(serum creatinine,SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)檢測(cè)

對(duì)照組SCr和BUN各時(shí)點(diǎn)變化不大(P> 0.05)；CIN模型組SCr和BUN水平造膜后12 h逐漸升高，峰值出現(xiàn)在72 h，顯示造膜成功。除15 d外，模型組SCr和BUN水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠各時(shí)點(diǎn)SCr和BUN的比較

2 腎小管損傷評(píng)分

對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)大鼠腎臟的腎小管未見(jiàn)明顯損傷，病理評(píng)分無(wú)顯著差異(P> 0.05)。CIN模型組6 h即見(jiàn)腎小管損傷，24 h和48 h見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落、細(xì)胞變性壞死及再生，部分腎小管結(jié)構(gòu)受損，髓質(zhì)區(qū)受損最嚴(yán)重，部分腎間質(zhì)還可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化形成，72 h以后腎小管開(kāi)始逐漸出現(xiàn)修復(fù)，15 d基本恢復(fù)正常。CIN模型組的腎小管損傷評(píng)分顯著高于同一時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表3。

Figure 1. Comparison of histopathologic examination in different groups(HE staining, ×400).A：control; B:CIN.

表3 兩組大鼠各時(shí)點(diǎn)腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分的比較

3 免疫組化染色

KIM-1在造膜后6 h后就開(kāi)始大量表達(dá)，24 h達(dá)高峰。NF-κB及TNF-α亦在造膜后6 h后就開(kāi)始表達(dá)，48 h達(dá)高峰。除15 d外，模型組KIM-1、NF-κB和TNF-α的表達(dá)與對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)比較均有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

4 RT-PCR結(jié)果

建模后腎臟組織各時(shí)點(diǎn)KIM-1、NF-κB和TNF-α mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，分別在24 h、48 h和48 h達(dá)到高峰(P<0.05)，之后又逐漸下降恢復(fù)正常水平，見(jiàn)圖3。

5 Pearson相關(guān)分析

模型組腎小管損傷評(píng)分與腎組織NF-κB、TNF-α蛋白及NF-κB mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.843、0.758、0.743和0.707，均P<0.05)；模型組腎組織KIM-1蛋白表達(dá)與NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.863和0.807,均P<0.05)；模型組腎組織KIM-1 mRNA表達(dá)與NF-κB mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.839和0.855,均P<0.05)。

討 論

造影劑腎病是臨床不容忽視的問(wèn)題，但CIN的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。目前認(rèn)為CIN的可能發(fā)病機(jī)制主要有：(1)血流動(dòng)力學(xué)改變導(dǎo)致腎臟缺氧性損傷；(2)造影劑的直接細(xì)胞毒性效應(yīng)，包括造影劑能使尿酸、草酸鹽、Tamm-Horsfll 蛋白等排泄增加，加上脫水導(dǎo)致了腎小管的阻塞[3]；(3)促進(jìn)細(xì)胞凋亡并增加氧自由基損傷等[4]。而對(duì)CIN是否存在炎癥機(jī)制的研究尚少。

Figure 2. Expression of KIM-1, NF-κB and TNF-α at different time points (immunohistochemical staining, ×200).

Figure 3. Expression of KIM-1, NF-κB and TNF-α mRNA at different time points.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs 0 h.

1 造影劑對(duì)腎臟的損傷

本研究結(jié)果顯示，在靜脈注射造影劑后，腎臟病理評(píng)分和KIM-1的表達(dá)在24 h時(shí)為最高峰，而SCr和BUN水平的峰值遲后于腎臟損傷最嚴(yán)重時(shí)，且KIM-1的表達(dá)與腎臟損傷程度同步，考慮SCr和BUN并非腎臟損傷的早期敏感指標(biāo)，與Vaidya等[5]、Huo等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。正常情況下，在人及動(dòng)物腎組織中幾乎不表達(dá)KIM-1，但在腎缺血及腎毒性損傷后的近端小管上皮細(xì)胞頂膜高表達(dá)[7]，而在腎小球、腎小管周間質(zhì)細(xì)胞或內(nèi)髓細(xì)胞呈低表達(dá)[8]。在CIN中，隨著造影劑在腎小管內(nèi)濃度逐漸增加，造影劑逐漸對(duì)腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生直接毒性作用，導(dǎo)致腎小管腫脹、變性、壞死，甚至出現(xiàn)顆粒和空泡變性，特別是腎髓質(zhì)的髓袢和集合管尤為嚴(yán)重，KIM-1大量分泌[9-10]。CIN模型組KIM-1在建模6h后腎小管就開(kāi)始顯著表達(dá)，表達(dá)部位位于胞漿，髓質(zhì)區(qū)表達(dá)最強(qiáng)烈，在24 h達(dá)最高峰，之后逐漸降低恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)告相一致。本研究沒(méi)有檢測(cè)大鼠尿中的KIM-1，實(shí)驗(yàn)的主要目的在于探討CIN的發(fā)病機(jī)制，實(shí)驗(yàn)中主要利用KIM-1這一較成熟的生物學(xué)標(biāo)志來(lái)觀察和證實(shí)腎臟損傷程度，避免腎臟病理評(píng)分對(duì)腎損傷程度評(píng)價(jià)的偏差。

2 NF-κB 和TNF-α在CIN腎臟中的表達(dá)

NF-κB 廣泛存在于機(jī)體各種組織細(xì)胞中，參與多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄和級(jí)聯(lián)放大過(guò)程，是公認(rèn)的啟動(dòng)炎癥反應(yīng)瀑布的關(guān)鍵因子[11]。通常情況下，在靜止細(xì)胞中，組成NF-κB的p50/p65二聚體通常與其抑制因子(IκBα)結(jié)合而穩(wěn)定存在于胞質(zhì)中。潛伏形式的NF-κB可被多種誘導(dǎo)物如脂多糖、TNF-α等激活，誘導(dǎo)NF-κB活化并迅速進(jìn)入細(xì)胞核，與具有相同序列的各種基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子結(jié)合，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[12]。TNF-α為體內(nèi)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)因子,是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，TNF-α可以誘導(dǎo)NF-κB激活，NF-κB活化后可增強(qiáng)TNF-α基因的轉(zhuǎn)錄，使TNF-α產(chǎn)生和釋放增多，進(jìn)而再次激活NF-κB產(chǎn)生級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)[13]。張方等[14]的研究也表明NF-κB可正向調(diào)控TNF-α的分泌。

我們用免疫組化和RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了對(duì)照組和模型組NF-κB和TNF-α蛋白和mRNA的表達(dá)水平，提示模型組在造膜12 h后NF-κB和TNF-α表達(dá)就顯著增高，與對(duì)照組相比有顯著差異。免疫組化還提示在前期NF-κB的表達(dá)主要表達(dá)在胞漿中，之后逐漸由胞漿轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，在48 h表達(dá)最強(qiáng)烈，提示NF-κB誘導(dǎo)特異性基因序列轉(zhuǎn)錄的能力增強(qiáng)。CIN可誘導(dǎo)IκBα磷酸化，促使NF-κB活化并進(jìn)入細(xì)胞核。TNF-α在建膜12 h后皮質(zhì)區(qū)就開(kāi)始顯著表達(dá)，表達(dá)部位位于胞漿，之后陽(yáng)性區(qū)域逐漸向髓質(zhì)擴(kuò)大，表達(dá)強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，在48 h達(dá)高峰，而之后表達(dá)又逐漸降低，15 d少量表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在CIN的發(fā)生、發(fā)展中，腎臟NF-κB、TNF-α蛋白和mRNA表達(dá)均上調(diào)。

3 CIN中炎癥反應(yīng)機(jī)制探討

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，病理評(píng)分、KIM-1的表達(dá)與腎NF-κB、TNF-α的表達(dá)呈正相關(guān)，NF-κB、TNF-α的表達(dá)水平與腎損傷程度相一致。它們表達(dá)上調(diào)意味著炎癥反應(yīng)的發(fā)生和存在。在實(shí)驗(yàn)中，我們還觀察到造膜后24 h、48 h，腎臟病理可見(jiàn)少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及少量纖維化形成，也說(shuō)明CIN發(fā)生與炎癥反應(yīng)相關(guān)。Machado等[2]利用免疫印跡法在CIN大鼠模型中檢測(cè)到大量的NF-κB表達(dá)，并提出造影劑能誘導(dǎo)IκBα磷酸化作用增強(qiáng)，可加速NF-κB激活并迅速進(jìn)入細(xì)胞核，其研究結(jié)果表明降低NF-κB的活性可以減輕CIN炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。NF-κB和TNF-α在許多腎臟疾病，如狼瘡性腎炎[15]、IgA腎病[16]、 糖尿病腎病[17]、缺血-再灌注性腎損傷[18]、急性腎損傷[19]等的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。也有研究[20-21]表明抑制TNF-α表達(dá)或調(diào)控NF-κB通路可以減輕局部或相應(yīng)疾病的炎癥反應(yīng)作用。本研究示NF-κB和TNF-α在CIN腎組織中表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明CIN發(fā)病中存在炎癥反應(yīng)。

造影劑影響腎血流動(dòng)力學(xué)和直接腎小管毒性是CIN的主要發(fā)病機(jī)制，氧化應(yīng)激和ROS起了重要的鏈接作用。但炎癥反應(yīng)在CIN發(fā)病中是如氧化應(yīng)激和ROS一樣起鏈接作用？還是炎癥反應(yīng)本身就是導(dǎo)致CIN發(fā)生的因素？炎癥反應(yīng)在CIN發(fā)病中的作用如何？有效抑制炎癥反應(yīng)能否阻止CIN的發(fā)生和發(fā)展？這些問(wèn)題目前尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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