王艷娉 楊俊龍 張小梅△ 張 源

（1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院疼痛科，昆明 650032；2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，昆明 650032）

軟骨細(xì)胞微絲骨架的研究進(jìn)展*

王艷娉1楊俊龍1張小梅1△張 源2△

（1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院疼痛科，昆明 650032；2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，昆明 650032）

微絲骨架是細(xì)胞骨架的主要成分之一，在細(xì)胞的多種生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞形態(tài)的改變、細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞遷移和粘附、細(xì)胞分泌和吞飲、細(xì)胞收縮環(huán)的形成、細(xì)胞外基質(zhì)的形成等。相比其他細(xì)胞，軟骨細(xì)胞的微絲骨架有很多獨(dú)特之處，但針對(duì)該方面的研究，國(guó)內(nèi)缺乏系統(tǒng)與全面的總結(jié)。本文就軟骨細(xì)胞微絲骨架的結(jié)構(gòu)與分布、功能、影響因素及其與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系作一綜述。

軟骨細(xì)胞；微絲骨架；功能；影響因素；骨關(guān)節(jié)炎

細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，微絲骨架作為細(xì)胞骨架的主要成分之一，在細(xì)胞的多種生理過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞形態(tài)的改變、細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞遷移和粘附、細(xì)胞分泌和吞飲、細(xì)胞收縮環(huán)的形成、細(xì)胞外基質(zhì)的形成等。軟骨細(xì)胞微絲骨架除上述特性外，還對(duì)軟骨細(xì)胞的表型維持、分化、力學(xué)特性等有著重要意義，同時(shí)又受到應(yīng)力負(fù)荷、細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白、細(xì)胞因子等多種因素的調(diào)節(jié)，不同的機(jī)械刺激還可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部微絲骨架的結(jié)構(gòu)和表達(dá)發(fā)生變化，并引起多樣的細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，但具體機(jī)制目前尚不十分清楚[1]。軟骨細(xì)胞微絲骨架的這些特性使其與骨關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)疾病之間存在著密切的聯(lián)系，通過(guò)對(duì)軟骨細(xì)胞微絲骨架的深入研究，可進(jìn)一步了解這類關(guān)節(jié)疾病的發(fā)病機(jī)制，為疾病的預(yù)防和治療帶來(lái)新的思路。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者針對(duì)軟骨細(xì)胞微絲骨架的生物學(xué)特性及相關(guān)機(jī)制方面做了一系列的研究探討，但國(guó)內(nèi)對(duì)于該領(lǐng)域的研究相對(duì)較匱乏，本文就軟骨細(xì)胞微絲骨架目前的研究進(jìn)展作一綜述。

1.軟骨細(xì)胞微絲骨架的結(jié)構(gòu)與分布

軟骨細(xì)胞的微絲骨架(micro fi lament)是由肌動(dòng)蛋白亞基聚合而成的直徑約4～7 nm的實(shí)心狀纖維，故又稱肌動(dòng)蛋白纖維(actin fi lament, AF)。肌動(dòng)蛋白為球形蛋白，大小約43kDa，存在α、β和γ三種單體，軟骨細(xì)胞的微絲骨架主要由β單體構(gòu)成。在生理狀態(tài)下，微絲骨架中肌動(dòng)蛋白單體的聚合和解聚處于動(dòng)態(tài)平衡，球形的單體聚合后可形成纖維狀、具有高度組織性的微絲結(jié)構(gòu)。肌動(dòng)蛋白屬ATP酶，單體在Mg2+、K+或Na+的誘導(dǎo)下發(fā)生聚合，伴隨ATP的水解和肌動(dòng)蛋白ADP單體的形成。微絲骨架還具有極性，正極端生長(zhǎng)迅速，而負(fù)極端生長(zhǎng)緩慢。生理狀態(tài)下，Mg2+-ATP-肌動(dòng)蛋白復(fù)合體形成微絲正極端延長(zhǎng)的纖維狀結(jié)構(gòu)。隨著肌動(dòng)蛋白單體聚合，微絲延長(zhǎng)，ATP水解，磷酸鹽基團(tuán)解離，微絲負(fù)極端的肌動(dòng)蛋白ADP單體發(fā)生解離[2]。隨后，肌動(dòng)蛋白ADP單體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?dòng)蛋白ATP單體加入到正極端。微絲的這一過(guò)程稱為“踏車現(xiàn)象”，是軟骨細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞遷移的潛在驅(qū)動(dòng)力。

軟骨細(xì)胞的微絲骨架主要分布于軟骨細(xì)胞表層。在軟骨細(xì)胞內(nèi)，微絲骨架于細(xì)胞膜下形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分布于整個(gè)細(xì)胞，主要在核周和細(xì)胞突起處聚集。宏觀上，在軟骨組織的不同深度，微絲骨架的這種胞內(nèi)分布不發(fā)生改變。

2.軟骨細(xì)胞微絲骨架的功能

微絲參與真核細(xì)胞的多種生理活動(dòng)，包括細(xì)胞形態(tài)的改變、細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞遷移和粘附、細(xì)胞分泌和吞飲、細(xì)胞收縮環(huán)的形成、細(xì)胞外基質(zhì)的形成等。除此之外，在軟骨細(xì)胞中，微絲骨架也有其獨(dú)特的功能。

（1）微絲骨架維持軟骨細(xì)胞的表型

軟骨細(xì)胞微絲骨架具有維持其自身表型的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的形態(tài)。微絲骨架的重組會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞表型改變。已有研究表明，軟骨細(xì)胞在單層培養(yǎng)或使用維甲酸處理后發(fā)生去分化現(xiàn)象——軟骨細(xì)胞由球形變?yōu)楸馄剑憩F(xiàn)出成纖維細(xì)胞樣表型，軟骨細(xì)胞合成的Ⅱ型骨膠原和蛋白多糖也隨之減少，而Ⅰ型骨膠原合成增加，微絲結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，微絲延長(zhǎng)。然而，在加入細(xì)胞松弛素D后，去分化的軟骨細(xì)胞又重新變?yōu)榍蛐?，并重新表達(dá)Ⅱ型骨膠原和蛋白多糖[3]。細(xì)胞松弛素D是一種化學(xué)物質(zhì)，可破壞軟骨細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)，在微絲的末端加帽，使微絲骨架變短、裂解。隨后，Benya等人[4]的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞松弛素D破壞微絲結(jié)構(gòu)后，可使軟骨細(xì)胞在不改變形態(tài)的條件下，增強(qiáng)Ⅱ型骨膠原的合成，證實(shí)了軟骨細(xì)胞表型的重新表達(dá)并不是由于細(xì)胞形態(tài)的改變，而是由于微絲骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生了重排，微絲骨架的結(jié)構(gòu)是決定軟骨細(xì)胞表型的關(guān)鍵因素，軟骨細(xì)胞的去分化或再分化均依賴于微絲骨架。Nofal等人[5]的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，利用細(xì)胞松弛素D破壞微絲骨架后，軟骨細(xì)胞膜表面的CD44與其配體結(jié)合也減少，從而使得軟骨細(xì)胞外周基質(zhì)和細(xì)胞基質(zhì)中的蛋白多糖合成減少。因此，微絲骨架對(duì)維持軟骨細(xì)胞表型具有重要意義。

（2）微絲骨架調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化

微絲骨架對(duì)軟骨細(xì)胞的分化十分重要。早在1999年，Hayes等[6]學(xué)者的研究就發(fā)現(xiàn)，胚胎時(shí)期椎間盤纖維環(huán)發(fā)育時(shí)，纖維軟骨細(xì)胞的主要特征是肌動(dòng)蛋白表達(dá)上調(diào)，而在出生后不久，隨著纖維軟骨細(xì)胞分化形成纖維環(huán)，肌動(dòng)蛋白纖維逐漸減少、消失。隨后，Cai等[7]學(xué)者發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞中和纖維軟骨細(xì)胞中均表達(dá)α-肌動(dòng)蛋白，故推測(cè)微絲骨架與軟骨細(xì)胞的分化有關(guān)。近年來(lái)的研究表明，細(xì)胞松弛素D通過(guò)抑制微絲骨架肌動(dòng)蛋白的聚合，可刺激人類間充質(zhì)細(xì)胞和鼠胚胎干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，相關(guān)機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)軟骨形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SOX-9的表達(dá)完成的[8]。

（3）微絲骨架調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的力學(xué)特性

微絲骨架的另一作用就是調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的生物力學(xué)特性，它在軟骨細(xì)胞力傳導(dǎo)中扮演著中心角色。研究表明，用細(xì)胞松弛素D處理軟骨細(xì)胞后，微絲骨架被破壞，軟骨細(xì)胞的剛性下降90%，粘彈性下降80%[9]。與破壞中間纖維和微管相比，破壞微絲骨架會(huì)導(dǎo)致壓力下軟骨細(xì)胞的剛性下降更明顯[10]。Enda P. Dowling等學(xué)者[11]通過(guò)三維模擬技術(shù)發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞微絲骨架發(fā)生重塑后，細(xì)胞對(duì)剪切力的抵抗也隨之增強(qiáng)。

近年來(lái)，新的研究發(fā)現(xiàn)微絲骨架還可通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表層蛋白(super fi cial zone protein, SZP)的合成來(lái)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的力學(xué)特性。SZP是由表層軟骨分泌的一種粘液性蛋白多糖，對(duì)降低關(guān)節(jié)軟骨的摩擦系數(shù)有重要意義。Schmidt等[12]人發(fā)現(xiàn)單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，微絲延長(zhǎng)，SZP合成增加，且SZP的增加與軟骨細(xì)胞密度無(wú)關(guān)。另一方面，Klein等[13]人將軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于瓊脂糖三維環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)微絲骨架變短，SZP的合成減少約80%。Sean M等人的研究進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，使用細(xì)胞松弛素D破壞微絲骨架后，SZP的合成被顯著抑制，且呈劑量依賴性，這一過(guò)程是通過(guò)Rho家族作為介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的[14]。Rho家族是一組分子量在20-25kDa的GTP結(jié)合蛋白，具有GTP酶活性，故又稱Rho GTP酶，常見(jiàn)的成員有Rho，Rac，Cdc42等。Rho家族可通過(guò)其效應(yīng)分子參與到細(xì)胞的多種生理過(guò)程中。針對(duì)軟骨細(xì)胞微絲骨架，Rho家族可通過(guò)RhoA、ROCK直接調(diào)控微絲骨架中肌動(dòng)蛋白的聚合，從而發(fā)揮作用。

3.可影響軟骨細(xì)胞微絲骨架的相關(guān)因素

（1）應(yīng)力負(fù)荷對(duì)軟骨細(xì)胞微絲骨架的影響

應(yīng)力負(fù)荷是公認(rèn)的調(diào)節(jié)微絲骨架的中心環(huán)節(jié)。應(yīng)力負(fù)荷——包括流體靜壓、壓縮力、牽張力、剪切力、滲透壓等，均可導(dǎo)致微絲骨架結(jié)構(gòu)改變。研究證實(shí)，將微絲骨架從軟骨細(xì)胞純化分離后，應(yīng)力負(fù)荷可改變肌動(dòng)蛋白纖維的結(jié)構(gòu)。

大量研究表明流體靜壓和壓縮力可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞微絲骨架重塑。隨著流體靜壓的增加，軟骨細(xì)胞膜周微絲骨架的多邊形排列逐漸消失，若持續(xù)作用時(shí)間小于兩小時(shí)，引起的微絲結(jié)構(gòu)改變是可逆轉(zhuǎn)的[15]。同樣，壓縮力也可破壞微絲骨架，且與力的大小呈正相關(guān)。在0.5 MPa—4 MPa的循環(huán)壓力下，軟骨細(xì)胞微絲骨架未發(fā)生明顯改變；15 MPa的循環(huán)壓力下，微絲骨架數(shù)量開(kāi)始減少；大于24 MPa的循環(huán)壓力導(dǎo)致微絲骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)幾乎全部消失，軟骨細(xì)胞隨之回縮[16]。此外，軟骨細(xì)胞滲透環(huán)境的改變也會(huì)對(duì)微絲骨架造成影響。在250 mOsm的滲透壓下，軟骨細(xì)胞周邊的微絲骨架發(fā)生形態(tài)改變，隨著滲透壓的升高，微絲會(huì)逐漸發(fā)生重塑甚至瓦解[17]。

最近，Ganna Aleshcheva等[18]學(xué)者的研究證實(shí)重力也可改變軟骨細(xì)胞的微絲骨架。將軟骨細(xì)胞置于微重力裝置下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在持續(xù)22秒的失重狀態(tài)或31次拋物線飛行后，圍繞軟骨細(xì)胞膜邊緣的微絲骨架發(fā)生了重組，相應(yīng)的基因BMP-2和SOX-9也發(fā)生了上調(diào)，證明軟骨細(xì)胞微絲骨架對(duì)重力變化十分敏感。

（2）肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白對(duì)軟骨細(xì)胞微絲骨架的影響

軟骨細(xì)胞微絲骨架受多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的調(diào)控。Arp2/3、肌動(dòng)蛋白抑制蛋白等促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合作用；肌動(dòng)蛋白解聚因子家族、肌動(dòng)蛋白抑制蛋白、胸腺素β4等參與微絲的解聚作用；膠溶蛋白為微絲尾部加帽；細(xì)絲蛋白穩(wěn)定微絲骨架，作為微絲骨架和細(xì)胞膜及跨膜受體聯(lián)系的橋梁。最近的一項(xiàng)研究表明，Cfm蛋白也可改變微絲骨架，在Cfm1和Cfm2雙基因敲除的小鼠模型中，小鼠軟骨細(xì)胞的體積減小，細(xì)胞內(nèi)微絲骨架的數(shù)量減少[8]。

（3）細(xì)胞因子對(duì)軟骨細(xì)胞微絲骨架的影響

細(xì)胞因子也能調(diào)控軟骨細(xì)胞微絲骨架。由于細(xì)胞因子可影響軟骨細(xì)胞的合成代謝活動(dòng)，其對(duì)微絲骨架的調(diào)節(jié)可直接影響到細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。但目前針對(duì)細(xì)胞因子對(duì)微絲骨架影響的研究較少。研究表明，IL-1能增加軟骨細(xì)胞中微絲骨架的數(shù)量。Chen C等[10]人通過(guò)免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中加入IL-1β或TNF-α，其微絲骨架的免疫熒光標(biāo)記增強(qiáng)，提示IL-1β或TNF-α促使微絲的表達(dá)上調(diào)。這些研究從蛋白水平證實(shí)了軟骨細(xì)胞微絲骨架受細(xì)胞因子調(diào)控，同樣，基因水平的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。Joos等[19]人的研究發(fā)現(xiàn)LIM蛋白和FHL2導(dǎo)致軟骨細(xì)胞微絲骨架的mRNA水平下調(diào)。Fioravaniti等[20]學(xué)者發(fā)現(xiàn)IL-1β增加正常軟骨細(xì)胞和骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中微絲骨架的數(shù)量，并參與調(diào)節(jié)微絲骨架相關(guān)基因。相關(guān)的分子機(jī)制較為復(fù)雜，目前已確定的機(jī)制之一是細(xì)胞因子通過(guò)激活Rho/ROCK通路中的PK來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子對(duì)微絲骨架的調(diào)控。通過(guò)對(duì)以上研究進(jìn)行分析，可以推斷出在炎癥環(huán)境中，軟骨細(xì)胞微絲骨架的表達(dá)水平和組織結(jié)構(gòu)會(huì)受到影響。

（4）其他因素對(duì)軟骨細(xì)胞微絲骨架的影響

除上述影響因素外，微絲骨架還受多種因素調(diào)控。超聲對(duì)軟骨細(xì)胞微絲骨架也有影響。生理狀態(tài)下，微絲骨架主要分布于軟骨表層，在軟骨細(xì)胞質(zhì)中交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，超聲刺激下，軟骨細(xì)胞微絲骨架的分布發(fā)生變化，纖維樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，軟骨細(xì)胞形狀也被拉長(zhǎng)。在低強(qiáng)度彌漫性超聲下，微絲骨架受到破壞，在軟骨細(xì)胞內(nèi)呈間斷性分布[21]。藥物黃連素也可通過(guò)抑制PI-3激酶/Akt和p38激酶的激活使微絲骨架重組[22]。 軟骨細(xì)胞微環(huán)境也是影響微絲骨架組織結(jié)構(gòu)的重要因素[23]。

4.軟骨細(xì)胞微絲骨架與骨關(guān)節(jié)炎

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)軟骨退行性病變，其特點(diǎn)是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解、軟骨細(xì)胞破壞和滑膜炎癥。OA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全明確。軟骨細(xì)胞形態(tài)、功能的改變及細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分解代謝失衡是OA發(fā)病機(jī)制的一部分。微絲骨架對(duì)維持軟骨細(xì)胞的形態(tài)功能有重要作用，因此，我們可以推斷微絲骨架的改變與OA的發(fā)生、發(fā)展有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，研究軟骨細(xì)胞微絲骨架對(duì)了解OA的發(fā)病機(jī)制有重要意義。

研究表明，OA的發(fā)生伴隨著軟骨細(xì)胞基因表達(dá)和新陳代謝的改變。如Ⅱ型骨膠原和蛋白多糖的合成減少，炎性細(xì)胞因子和蛋白酶合成增多。而軟骨細(xì)胞的新陳代謝又受細(xì)胞形態(tài)和微絲骨架結(jié)構(gòu)的影響。如前所述，由于軟骨細(xì)胞的微絲骨架變短，細(xì)胞呈現(xiàn)為球形，則軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型骨膠原和蛋白多糖增多，反之則Ⅱ型骨膠原和蛋白多糖減少，故微絲骨架的重塑可能是OA發(fā)生、發(fā)展的原因之一。Kouri等[24]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，與正常軟骨細(xì)胞相比，OA軟骨細(xì)胞中微絲骨架的熒光分布發(fā)生改變，在OA軟骨的表層和中層，微絲骨架呈團(tuán)塊狀或環(huán)狀集中分布于軟骨細(xì)胞外周，而在OA軟骨的深層，微絲骨架呈團(tuán)塊狀集中分布于軟骨細(xì)胞核周。Kouri等判斷是這些改變導(dǎo)致了OA軟骨細(xì)胞形態(tài)與正常軟骨細(xì)胞的不同，故認(rèn)為微絲骨架破壞是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退化的重要因素之一。Fioravaniti等[25]學(xué)者也指出，OA軟骨細(xì)胞的微絲骨架較正常軟骨細(xì)胞分布得更為分散、不易被確認(rèn)或是局限在細(xì)胞周邊，并由此推斷可能是由于軟骨細(xì)胞的微絲骨架不能被正確組裝，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的新陳代謝以及其對(duì)應(yīng)力負(fù)荷或細(xì)胞因子的應(yīng)答受到影響，從而促進(jìn)OA的發(fā)生發(fā)展。但有趣的是，F(xiàn)ioravaniti等[26]隨后的研究卻得出相反的結(jié)論，將OA軟骨細(xì)胞置于循環(huán)壓力下，微絲骨架的分布并未發(fā)生改變。對(duì)該現(xiàn)象分析表明，可能是OA的發(fā)生引起了軟骨細(xì)胞的微絲骨架不可逆的改變。因此，微絲骨架在OA中到底扮演著什么角色，這一問(wèn)題還需進(jìn)一步探討。

5.展望

微絲骨架是如何參與OA發(fā)病機(jī)制的？是微絲骨架的改變導(dǎo)致了OA？還是OA引起了微絲骨架的改變？亦或是兩者均有？至今這一點(diǎn)還未明確，有待進(jìn)一步探討。顯然，我們還需做更多的研究去了解微絲骨架與OA的確切關(guān)系；去證明微絲骨架的改變會(huì)對(duì)OA的發(fā)生、發(fā)展帶來(lái)什么影響；去求證藥物干預(yù)或/和理療是否可以改變，甚至逆轉(zhuǎn)這些影響。毫無(wú)疑問(wèn)，對(duì)軟骨細(xì)胞微絲骨架進(jìn)行更深入的研究有望對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療帶來(lái)新思路與新指導(dǎo)。

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10.3969/j.issn.1006-9852.2017.05.012

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△通訊作者 張小梅 xm6408@hotmail.com ;張?jiān)?zhhyya@163.com