顧曙余 王士維 劉梅

摘? 要：利用鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞，制備細(xì)胞爬片，并分別運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)R250和FITC-鬼筆環(huán)肽來染色顯示細(xì)胞微絲，探索和改進(jìn)實(shí)驗方法，以便有效觀察細(xì)胞微絲的分布和形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，采用鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞作為實(shí)驗材料，傳代成纖維狀細(xì)胞鋪展良好，經(jīng)固定、通透并染色后，可在普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下顯示微絲束在細(xì)胞中的分布，既便于實(shí)驗觀察，也有助于學(xué)生對微絲骨架作用的理解和掌握。

關(guān)鍵詞：微絲;細(xì)胞骨架;熒光顯微鏡

中圖分類號 G642.0文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）（02-03）-0131-02

Abstract：In order to improve experimental methods of the cell microfilament observation experiments，mouse embryonic subcultured cells were used as experimental materials，and well passaged on the glass coverslips.After the cells were fixed and permeabilized，cell microfilaments were stained and displayed using Coomass R250 and FITC-Phalloidin respectively.The results showed that under the bright microscope and fluorescence microscope，the cell microfilaments can be displayed more clearly and effectively.It is easy for experimental observation and helps students understand the role of the microfilament cytoskeleton.

Key words：Microfilament;Cytoskeleton;Fluorescence microscope

在細(xì)胞內(nèi)，微絲是由肌動蛋白分子螺旋狀聚合形成的纖維絲，而肌動蛋白又以肌動蛋白單體（或稱球狀肌動蛋白，G-actin）或由單體組裝而成的纖維狀肌動蛋白（F-actin）多聚體2種形式存在。F-actin是由多個G-actin構(gòu)成的長鏈纖維，2條F-actin反相平行結(jié)合成螺旋鏈，發(fā)揮生理功能。由微絲形成的微絲束又稱為應(yīng)力纖維，常橫貫于細(xì)胞長軸。微絲對細(xì)胞貼附、鋪展、運(yùn)動、內(nèi)吞、細(xì)胞分裂等許多細(xì)胞功能起著重要作用，而微絲又與微管、中間絲組成真核細(xì)胞中的三維纖維網(wǎng)絡(luò)骨架體系，這些由蛋白質(zhì)聚合而成的細(xì)胞骨架主要功能包括：調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)容物的空間分布，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動及形態(tài)。研究表明，細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)受到多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，細(xì)胞骨架的改變也與一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]，如囊性纖維化肺這一慢性疾病除了受到相關(guān)基因調(diào)控外，還提示與誘導(dǎo)增加肌動蛋白的聚合，從而促進(jìn)微絲束的形成相關(guān)[2]。

“動物細(xì)胞微絲的觀察”是生物科學(xué)本科層次開設(shè)的實(shí)驗必修項目之一，現(xiàn)有的教學(xué)實(shí)驗參考指導(dǎo)書[3-5]，大多所列實(shí)驗步驟較復(fù)雜，實(shí)驗所用細(xì)胞及試劑材料無法購買，或在本科實(shí)驗教學(xué)中顯示效果不明顯。近年來，筆者在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗教學(xué)中，利用鼠胚組織進(jìn)行原代培養(yǎng)并成功傳代培養(yǎng)形成的成纖維狀細(xì)胞作為實(shí)驗材料，開展了動物細(xì)胞骨架的標(biāo)記及觀察實(shí)驗。實(shí)驗分別采用非特異性蛋白質(zhì)染料考馬斯亮藍(lán)，以及特異性熒光染料FITC-鬼筆環(huán)肽來標(biāo)記染色，通過光學(xué)顯微鏡與熒光顯微鏡來觀察微絲在細(xì)胞中的分布及形態(tài)特征。與考馬斯亮藍(lán)R250這一普通蛋白質(zhì)染料不同，鬼筆環(huán)肽是從毒性菇類中分離的生物堿，它同細(xì)胞松弛素的作用相反，不與肌動蛋白單體分子結(jié)合，只與多聚體的F-actin結(jié)合，而用FITC或Rhodamin等熒光物質(zhì)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可特異性的顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布。

1 實(shí)驗材料

實(shí)驗細(xì)胞：小鼠鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞（來源于本科學(xué)生培養(yǎng)的鼠胚組織原代培養(yǎng)細(xì)胞）。

實(shí)驗試劑及器材：1640培養(yǎng)基、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液、4%多聚甲醛、0.1%TritonX-100、0.25%考馬斯亮藍(lán)R250、5μg/mL的FITC-鬼筆環(huán)肽、5μg/mL Hochest33258、24孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板用圓形細(xì)胞爬片（即圓形蓋片，直徑14mm）、parafilm封口膜。

2 實(shí)驗方法

2.1 細(xì)胞爬片的制備 將生長良好的鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞消化后，稀釋細(xì)胞至104～105個/mL濃度。準(zhǔn)備24孔培養(yǎng)板，每孔預(yù)先放入適量血清培養(yǎng)基，并放入無菌圓形爬片，細(xì)胞添加至圓形爬片上方。如不用24孔培養(yǎng)板，爬片也可放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。37℃，5%CO2條件下繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞的固定及通透 24h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，標(biāo)記生長良好的培養(yǎng)孔，吸去培養(yǎng)基，用37℃預(yù)溫PBS輕輕清洗細(xì)胞3次，快速洗去殘留的培養(yǎng)基及血清。加入4%的多聚甲醛固定20min，吸去固定液，再用PBS清洗細(xì)胞3次。加入0.1%TritonX-100處理20～30min，繼續(xù)用PBS清洗細(xì)胞3次。小心取出在24孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)有鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞的蓋片，略晾干后，進(jìn)行后續(xù)的染色實(shí)驗。

2.3 制片及染色方法 首先，在2片封口膜上分別滴加0.25%考馬斯亮藍(lán)R2505μL和5μg/mL的FITC-鬼筆環(huán)肽5μL。取出處理過的細(xì)胞爬片倒扣在膜上室溫避光染色40min（即細(xì)胞面朝下反扣在預(yù)加染色液的膜上），夏季時間可以短一些。染色完成后用PBS輕緩沖洗清洗細(xì)胞3次，洗去多余的染液?？捡R斯亮藍(lán)染色的細(xì)胞爬片，可待爬片稍晾干后，直接放于載玻片上用普通光學(xué)顯微鏡在白光下觀察。而用FITC-鬼筆環(huán)肽染色的細(xì)胞爬片，繼續(xù)倒扣在5μg/mLHochest33258染液中染色細(xì)胞5～10min，用PBS清洗細(xì)胞3次后，細(xì)胞爬片也同樣放在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察。

2.4 普通光學(xué)顯微及熒光顯微鏡的觀察 染色細(xì)胞爬片均運(yùn)用Olympus BX41顯微鏡觀察，40倍物鏡下已能清晰觀察到鋪展良好的成纖維狀鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞，用DP70攝像頭進(jìn)行顯微拍攝，并用Image Pro Plus 5.0（IPP）軟件對所有顯微照片進(jìn)行標(biāo)尺標(biāo)記，雙熒光圖片則使用IPP軟件進(jìn)行熒光照片的拼合。

3 結(jié)果與分析

3.1 考馬斯亮藍(lán)R250染色效果 運(yùn)用普通光學(xué)顯微鏡在白光下觀察，鼠胚傳代成纖維狀細(xì)胞的生長分裂旺盛，細(xì)胞鋪展好，形態(tài)舒展并有較多的細(xì)胞附著在蓋玻片上，可清晰觀察到考馬斯亮藍(lán)染色的鼠胚細(xì)胞胞體突出豐富，立體感強(qiáng)，不僅可見染成淺藍(lán)色縱貫細(xì)胞軸的微絲，還可見染成深藍(lán)色的細(xì)胞核。

3.2 雙熒光染料染色效果 用FITC-鬼筆環(huán)肽與Hochest33258雙熒光染色的細(xì)胞，用紫外光激發(fā)，則細(xì)胞核產(chǎn)生明亮的藍(lán)色熒光，而用藍(lán)光激發(fā)，微絲則產(chǎn)生清晰的綠色熒光。用IPP軟件拼合標(biāo)記細(xì)胞核及微絲。

4 結(jié)論

在“動物細(xì)胞微絲的觀察”教學(xué)實(shí)驗中，我們運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)R250和FITC-鬼筆環(huán)肽對微絲進(jìn)行對照標(biāo)記顯示?？捡R斯亮藍(lán)并不能夠特異性地顯示細(xì)胞微絲的分布，是利用Triton X-100處理細(xì)胞后可以脫除不穩(wěn)定的非骨架蛋白，而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的微絲蛋白仍能保留下來染色顯示。而用FITC熒光物質(zhì)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可特異性的顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布，在本實(shí)驗中顯示效果好，熒光清晰，染色對比明顯，有助于學(xué)生對細(xì)胞微絲理解和掌握。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗是一門單獨(dú)設(shè)課的實(shí)驗課程，實(shí)驗課只在每周固定時間段開設(shè)，學(xué)生無法連續(xù)進(jìn)行實(shí)驗。近年來，通過多次試驗、反復(fù)摸索和研究，形成了從鼠胚原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、細(xì)胞活性觀察、細(xì)胞骨架染色顯示及運(yùn)用CCK8法檢測細(xì)胞增殖這一系列可每周單獨(dú)設(shè)課的連續(xù)實(shí)驗內(nèi)容。其中“動物細(xì)胞微絲的觀察”這一實(shí)驗項目，根據(jù)實(shí)驗設(shè)計，實(shí)驗從已制備好的細(xì)胞爬片開始，到最后完成細(xì)胞微絲的顯微觀察大約需要4個學(xué)時。微絲顯示效果好，學(xué)生參與度高，取得了很好的教學(xué)效果。

參考文獻(xiàn)

[1]陳業(yè)成，趙洪文.細(xì)胞骨架與腫瘤之間的關(guān)系研究進(jìn)展[J].國際呼吸雜志，2018（12）：933-936.

[2]Corvol H，Rousselet N，Thompson K E，et al.FAM13A is a modifier gene of cystic fibrosis lung phenotype regulating rhoa activity，actin cytoskeleton dynamics and epithelial-mesenchymal transition[J].Journal of Cystic Fibrosis，2018，17（2）：190-203.

[3]李素文.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2001.

[4]丁明孝，蘇都莫日根，王喜忠，等.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗教程[M].北京：高等教育出版社，2013.

[5]桑建利，譚信.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗指導(dǎo)[M].北京：科學(xué)出版社，2010.

（責(zé)編：張宏民）