楊君，王建華，劉靖靖，李立，顏冬云

（1.青島大學(xué)，山東青島 266071； 2.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266002；3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查飲料中6種人工合成甜味劑*

楊君1，2，王建華2，劉靖靖2，李立3，顏冬云1

（1.青島大學(xué)，山東青島 266071； 2.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266002；3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

建立了高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測飲料中糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖6種人工合成甜味劑的方法。樣品經(jīng)水提取，采用C18色譜柱，以甲醇和0.1%甲酸-10 mmol／L甲酸銨溶液為流動相，梯度洗脫，四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧負(fù)離子模式檢測。各化合物在0.02～2.0 mg／L范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.998。樣品平均添加回收率為63.0%～113.2%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于9.6%(n=5)。該方法簡便快捷，選擇性好，靈敏度高，可滿足國內(nèi)外現(xiàn)行法規(guī)的限量要求。

液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜；人工合成甜味劑；篩查；飲料

甜味劑是一類重要的食品添加劑，按其來源可以分為天然甜味劑和人工合成甜味劑。人工合成甜味劑在人體內(nèi)不進(jìn)行代謝吸收，用量小，不提供熱量或產(chǎn)生的熱量少而甜度高，因而被廣泛應(yīng)用于食品飲料中［1］。多數(shù)國家批準(zhǔn)使用的品種主要有安賽蜜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精、三氯蔗糖等［2］。科學(xué)研究表明，人工合成甜味劑能致使某些動物產(chǎn)生腫瘤，因此為避免其對人體產(chǎn)生潛在危險，必須限制食品飲料中甜味劑的用量。

美國、歐盟、日本等國對食品中甜味劑的使用有嚴(yán)格規(guī)定［3］，我國衛(wèi)生部發(fā)布的GB 2760-2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，飲料中安賽蜜的限量為0.3 g／kg，糖精鈉為0.15 g／kg，甜蜜素為0.65 g／kg，三氯蔗糖為0.25 g／kg，阿斯巴甜和紐甜可在任何食品中按需使用。食品中甜味劑的檢測方法［4］主要有高效液相色譜法［5-6］、液相色譜-質(zhì)譜法［7-8］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［9-11］、氣相色譜法［12-13］等。

四極桿飛行時間質(zhì)譜(Q TOF MS)屬于高分辨質(zhì)譜，可根據(jù)化合物及碎片離子的精確質(zhì)量對其進(jìn)行定性分析，增加了定性的準(zhǔn)確度。使用液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜檢測飲料中甜味劑的國外報道較少［14］，國內(nèi)則未見報道。筆者用高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-Q TOF MS)分析技術(shù)，建立了飲料中糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖6種常用人工合成甜味劑的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀（Agilent 1200型）／四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（6520 Accurate Mass型）：美國Agilent公司；

電子天平：PL303型，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

乙腈、甲酸、乙酸銨、甲酸銨：色譜純，美國Honeywell Burdick &Jackson Muskegon公司；

安 賽 蜜(Acesulfame-K)、糖 精 鈉(Sodium Saccharin)、甜 蜜 素 (Cyclamate)、三 氯 蔗 糖(Sucralose)、阿斯巴甜(Aspartame)、紐甜(Neotame)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度均為99.0%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

實驗室用水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品各0.050 0 g于50 mL棕色容量瓶中，用純水溶解并定容，配制成1 mg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Eclispe XDB-C18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm，美國Agilent公司)，卡套式保護(hù)柱(C18填料)；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動相：A為甲醇，B為0.1%甲酸-10 mmol／L甲酸銨溶液；梯度洗脫程序：0～1.0 min為98% B，1.0～5.0 min由98% B降至20% B，5.0～7.0 min為20% B，7.0～20.0 min為98% B；流速：0.3 mL／min。

1.3.2 Q TOF MS條件

電噴霧源(ESI)負(fù)離子模式；干燥氣：氮?dú)?，溫度?50℃，流量為11 L／min；霧化氣壓力：275.8 kPa(40 psi)；毛細(xì)管電壓：4 000 V；傳輸電壓：140 V；掃描模式：全掃描；掃描范圍：m／z 100～1 100；參比離子：m／z 121.985 6，1 033.988 1。

1.4 實驗方法

取1.0 mL樣品至50 mL容量瓶中，用純水定容至標(biāo)線，超聲提取20 min，過0.22 μm尼龍濾膜，濾液供HPLC-Q TOF MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜流動相的優(yōu)化

對色譜流動相進(jìn)行了優(yōu)化，考察了甲醇-乙酸銨-甲酸和甲醇-甲酸銨-甲酸體系，發(fā)現(xiàn)甲醇-乙酸銨-甲酸體系下阿斯巴甜響應(yīng)稍高，但安塞蜜和糖精鈉的響應(yīng)較低，并且峰形對稱性差；甲醇-甲酸銨-甲酸體系分離響應(yīng)較好，故選擇甲醇-甲酸銨-甲酸水溶液作為色譜流動相。

采取大梯度的洗脫方式，即起始為98%水相，在5 min內(nèi)變化到20%水相，盡可能使各種化合物在較短的時間內(nèi)分離。同時考察了流動相A和B的比例，試驗發(fā)現(xiàn)，流動相A和B的比例改變對安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素的測定結(jié)果影響較小，在一定時間內(nèi)均會出峰；但流動相A和B的比例不恰當(dāng)會導(dǎo)致出現(xiàn)三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜不出峰或峰形很差的情況。

2.1.2 離子化模式的優(yōu)化

在優(yōu)化的色譜條件下，對比了ESI+和ESI-兩種模式對6種甜味劑質(zhì)譜響應(yīng)的影響。試驗結(jié)果表明，紐甜、三氯蔗糖、阿斯巴甜在正、負(fù)模式下均有響應(yīng)，且正模式的響應(yīng)要比負(fù)模式強(qiáng)；糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜3種化合物在正模式下沒有響應(yīng)。考慮到正負(fù)離子模式頻繁轉(zhuǎn)換易造成儀器不穩(wěn)定，而6種甜味劑在負(fù)模式下響應(yīng)均能滿足要求，故實驗選擇ESI-模式下檢測6種甜味劑。

5)旅游設(shè)施和管理缺失。由于森林古道地理位置特殊，尤以海拔較高處管理相對薄弱，缺乏相應(yīng)的旅游設(shè)施，游客上山所攜帶的食品包裝成為隨處可見的垃圾。部分游客在人文古跡上亂涂亂畫，另有游客進(jìn)行燒烤野炊等污染環(huán)境的行為。

2.1.3 傳輸電壓的優(yōu)化

傳輸電壓是HPLC-TOF MS的一項關(guān)鍵參數(shù)，該參數(shù)對待測物的檢測靈敏度和特征離子碎片信息的豐富程度有直接影響，因此需要優(yōu)化傳輸電壓以使目標(biāo)化合物產(chǎn)生最大響應(yīng)信號且生成較少的碎片離子。在其它優(yōu)化條件下，著重考察從90 V到200 V的傳輸電壓。隨著電壓增大，甜味劑的響應(yīng)值逐漸升高，到達(dá)某一電壓時最高；再升高電壓時，響應(yīng)值降低或不變，綜合考慮選擇140 V作為最佳傳輸電壓。

2.2 HPLC-Q TOF MS定性分析

對樣品進(jìn)行全掃描，利用分子離子精確質(zhì)量的理論值與測量值的質(zhì)量偏差小于5×10-6及特征碎片離子對化合物進(jìn)行定性。

在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下對6種甜味劑進(jìn)行分析，分子離子峰精確相對分子質(zhì)量的理論值和測量值以及質(zhì)量偏差列于表1?；贖PLC-Q TOF MS負(fù)離子掃描模式的6種甜味劑的分子特征離子提取色譜圖見圖1。

表1 各化合物母離子理論質(zhì)荷比、實測質(zhì)荷比及匹配結(jié)果

圖1 6種甜味劑的提取離子色譜圖

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)是樣品中被分析物以外的組分，常對分析物的分析有顯著干擾，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)［15］。為研究基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，取陰性果醋飲料、飲料及冰糖雪梨飲料按1.4實驗方法處理，用得到的溶液配制成2.0 mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，與純水配制的2.0 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較。

式中：A——與基質(zhì)相同體積純水處理后加入相同量標(biāo)準(zhǔn)品所測得峰面積；

B——基質(zhì)處理后加入相同量標(biāo)準(zhǔn)品所測得峰面積。

根據(jù)式(1)，除果醋中的甜蜜素測定值增大80.1%、麥芽汁發(fā)酵飲品中的阿斯巴甜測定值增大了21.7%外，其余甜味劑的基質(zhì)效應(yīng)值均在±10%以內(nèi)，尤其是陰性的冰糖雪梨飲料，其基質(zhì)效應(yīng)值在±8%以內(nèi)，說明陰性樣品基質(zhì)對樣品檢測的影響不大，因而在驗證方法可行性時采用陰性樣品提取液作為溶劑；而含有某種甜味劑的陽性樣品中該甜味劑會影響檢測結(jié)果。因此本方法最終采用基質(zhì)匹配外標(biāo)校準(zhǔn)曲線對樣品中的甜味劑進(jìn)行定量，以抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4 線性方程

6種甜味劑在0.02～2.0 mg／L濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度x與色譜峰面積y呈良好的線性關(guān)系(r≥0.998)，以6種甜味劑測量信噪比S／N=3時的進(jìn)樣濃度定義為檢出限，結(jié)果列于表2。

表2 6種人工甜味劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 回收試驗與精密度試驗

通過向陰性飲料樣品中添加低(0.1 mg／L)、中(0.5 mg／L)、高(1.0 mg／L)3個濃度水平的甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收試驗和精密度試驗，每個濃度樣品平行測定5次，測定結(jié)果見表3。由表3可見，6種甜味劑的回收率在63.0%～113.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～9.6%。

表3 6種人工甜味劑的添加回收率、精密度

2.6 實際樣品檢測

采用Aglient 公司的質(zhì)譜分析軟件建立甜味劑的精確分子質(zhì)量及Q TOF MS的數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用本方法對市售果醋、麥芽汁發(fā)酵飲品、奶茶、山楂果肉飲料、荔枝汁飲料、白蘭地、葡萄酒、白酒等進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果：果醋樣品中含安賽蜜314.6 mg／L、甜蜜素204.7 mg／L、阿斯巴甜161.8 mg／L；麥芽汁發(fā)酵飲品中含安賽蜜14.1 mg／L、阿斯巴甜11.5 mg／L；其余樣品均沒有檢出。

3 結(jié)語

建立了飲料中糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖6種人工合成甜味劑的高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜快速分析方法。樣品經(jīng)簡單的前處理，利用四極桿-飛行時間質(zhì)譜的精確質(zhì)量定性實現(xiàn)化合物的定性。本方法簡便快捷，靈敏度高，可滿足國內(nèi)外現(xiàn)行法規(guī)的限量要求。

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Analysis of 6 Synthetic Sweeteners in Beverage by Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry

Yang Jun1，2, Wang Jianhua2, Liu Jingjing2, Li Li3, Yan Dongyun1
(1. Qingdao University, Qingdao 266071, China; 2. Shandong Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China; 3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

A new method was established for the determination of 6 synthetic sweeteners (sodium saccharin, cyclamate, acesulfame-K, aspartame, neotame, sucralose) in beverage, by using high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q TOF MS). The samples were extracted by water and measured directly by HPLC-Q TOF MS with electrospray ionization in negative mode. The compounds were separated by a C18column with methyl alcohol and 0.1% formic acid-10 mmol／L ammonium formate solution as the mobile phase. A detailed fragmentation study for 6 synthentic sweeteners was carried out by time of fl ight. The 6 compounds behave linearly in the range of 0.02-2.0 mg／L with the correlation coeff i cient of more than 0.998. The recoveries were 63.0%-113.2%, with coeff i cients of variation below 9.6%(n=5). The method is suitable for routine qualitative and quantitative analyses of synthetic sweeteners in beverage.

high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry; artificial sweeteners; screening; beverage

O657.7

A

1008-6145(2014)02-0009-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.02.003

*國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研項目（2012424012-2）

聯(lián)系人：李立；Email: whywrs9@163.com

2013-03-08