龔惠娥

[摘要] 目的 探討補(bǔ)腎益氣活血中藥對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的動(dòng)態(tài)變化與血腦屏障（BBB）通透性改變的影響。方法 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、生理鹽水組、中藥組，采用線拴法建立腦缺血模型。采用伊文思藍(lán)（EB）熒光測(cè)定法分別對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行缺血再灌注1、3、7d后的EB含量變化情況進(jìn)行檢測(cè)；采用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果 生理鹽水組和中藥組大鼠再灌注1、3、7d后濕腦組織中EB含量分別為（4.69±0.97）μg/g、（5.89±1.13）μg/g、（3.97±0.67）μg/g和（3.32±1.43）μg/g、（4.27±1.48）μg/g、（3.19±0.64）μg/g，均高于假手術(shù)組的（2.12±0.45）μg/g （P <0.05）。中藥組大鼠濕腦組織中EB含量在同一時(shí)間點(diǎn)均明顯低于生理鹽水組（P <0. 05）。 結(jié)論 補(bǔ)腎益氣活血中藥可通過對(duì)血腦屏障功能的改善減輕血管源性腦水腫。

[關(guān)鍵詞] 腦缺血再灌注；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；血腦屏障

[中圖分類號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）13-0001-03

缺血性腦血管病一個(gè)重要致病因素就是腦缺血再灌注，其損傷后修復(fù)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）變化情況和血腦屏障（BBB）的通透性有密切聯(lián)系[1]。本研究通過對(duì)損傷后大鼠VEGF的動(dòng)態(tài)變化與BBB通透性的測(cè)定，探討補(bǔ)腎益氣活血中藥在缺血性腦血管病中的作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1一般資料

選用清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠（上海義森生物科技有限公司）。大鼠體重260～310g，鼠齡7～11周，實(shí)驗(yàn)前在清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)1周。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組12只，生理鹽水組36只，中藥組36只。各組大鼠均分為兩小組，經(jīng)缺血90min再灌注1、3、7d。

1.2方法

1.2.1建立模型 建立模型參照改良的Longa法[2]。用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎近心端，動(dòng)脈夾夾于遠(yuǎn)心端。剪開小口，插入15 mm尼龍絲線，外留15～20mm。近心端結(jié)扎該動(dòng)脈，全層縫合切口，抽出尼龍絲線至頸內(nèi)動(dòng)脈起始部。維持實(shí)驗(yàn)室室溫為（23±1）℃。大鼠出現(xiàn)左側(cè)Horner征為成功標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.2.2給藥方法 生理鹽水組和中藥組分別以1.67mL/kg、2次/d腹腔注射生理鹽水和補(bǔ)腎益氣活血中藥。

1.2.3 VEGF的動(dòng)態(tài)變化測(cè)定 VEGF的檢測(cè)方法采用免疫組化SABC進(jìn)行。染色按試劑盒說明進(jìn)行。大鼠到達(dá)灌注時(shí)間點(diǎn)后采用10%水合氯醛（350mg/kg）進(jìn)行麻醉。用4%多聚甲醛（PBS，0.1mol，pH7.4）固定48h。石蠟包埋，取視交叉平面觀察。VEGF蛋白染色呈棕黃色顆粒，取高倍鏡下缺血區(qū)5個(gè)視野里陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算均值并記錄。

1.2.4血腦屏障通透性測(cè)定 采用EB為標(biāo)蹤劑，各小組隨機(jī)取8只大鼠，按20mg/kg自尾靜脈注入2%EB液，2h后處死。標(biāo)準(zhǔn)：大鼠結(jié)膜、四肢等呈藍(lán)色。取染色后大鼠腦左半球稱重、粉碎，加入甲酰胺（25mg/1mL），加蓋避光，37℃水浴72h。參照說明書用熒光分光光度儀測(cè)定提取液的熒光強(qiáng)度并記錄。用倍比稀釋法做出EB濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算EB濃度的線性回歸方程，求出腦組織EB濃度及含量[4]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選擇SPSS18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，濕腦組織中EB含量和腦組織不同再灌注時(shí)間缺血區(qū)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)等為計(jì)量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組大鼠在相同灌注時(shí)間差異，采用t檢驗(yàn)，同組大鼠不同灌注時(shí)間觀察指標(biāo)比較采用方差分析。當(dāng)P<0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 BBB通透性改變情況

生理鹽水組和中藥組濕腦組織中EB含量均明顯高于假手術(shù)組（P<0.05）。中藥組大鼠濕腦組織中EB含量在同一時(shí)間點(diǎn)均明顯低于生理鹽水組（P<0.05）。兩組大鼠均灌注1d時(shí)，t=2.2425，P=0.0416；灌注3d時(shí)，t=2.4607，P=0.0275；灌注7d時(shí)，t=2.3811，P=0.0320。生理鹽水組內(nèi)不同灌注時(shí)間之間EB含量比較，經(jīng)過方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.47，P=0.0020）。中藥組內(nèi)不同再灌注時(shí)間之間比較差異不明顯（P>0.05）。見表1。

表 1 濕腦組織中EB含量（x±s，μg/g）

注：與假手術(shù)組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P <0.05 **P <0.01） ；與同組上一時(shí)間點(diǎn)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P <0.05） ；與同一時(shí)間點(diǎn)生理鹽水組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（△P <0.05 ※※P <0.01）

2.2 VEGF免疫組化染色結(jié)果

假手術(shù)組未檢測(cè)出陽性細(xì)胞。中藥組濕腦組織中VEGF陽性細(xì)胞在同一時(shí)間點(diǎn)均僅略高于生理鹽水組，中藥對(duì)VEGF蛋白表達(dá)無影響（P>0.05）。生理鹽水組組內(nèi)不同灌注時(shí)間之間陽性細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)過方差分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=965.37，P=0.0000）。生理鹽水組內(nèi)各灌注時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)與上一時(shí)間點(diǎn)比較，灌注3d時(shí)，（t=34.7468，P<0.01）、灌注7d時(shí)，（t=2.2611，P=0.0402）。均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥組組內(nèi)不同灌注時(shí)間之間陽性細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)過方差分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1319.07，P=0.0000）。中藥組各灌注時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)與上一時(shí)間點(diǎn)比較，灌注3d時(shí)（t=40.0840，P<0.01）；灌注7d時(shí)（t=2.5310，P=0.0240）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表 2 腦組織不同再灌注時(shí)間缺血區(qū)免疫組化結(jié)果

（x±s，個(gè)/高倍視野，×400）

注：與同組上一時(shí)間點(diǎn)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P <0.05）；中藥組與同一時(shí)間點(diǎn)生理鹽水組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P>0.05）

3討論

腦缺血再灌注是造成缺血性腦血管病一個(gè)重要原因[5]。臨床上因?yàn)榛颊叱霈F(xiàn)血性腦血管病而引起一系列相應(yīng)的腦損傷病癥如Horner 征等往往是討論的一項(xiàng)重要課題。有研究報(bào)道，腦梗死等缺血性腦部病變患者的病情狀況與缺血腦組織中微血管密度程度及其動(dòng)態(tài)變化情況密切相關(guān)[6，7]。補(bǔ)腎益氣活血?jiǎng)t是臨床上一種極為常見的治療方法，其對(duì)VEGF的動(dòng)態(tài)變化和BBB通透性影響的研究具有重要意義[8]。

本研究顯示，腦缺血再灌注后BBB通透性的改變?yōu)橐粍?dòng)態(tài)變化過程。在缺血再灌注24h時(shí)，腦組織中EB含量已明顯高于假手術(shù)組。當(dāng)缺血再灌注72h后，腦組織中EB含量已達(dá)到峰值，且隨著時(shí)間推移，其濃度逐漸降低，直至7d時(shí)僅稍高于缺血再灌注24h時(shí)。血腦屏障的破壞導(dǎo)致腦部出現(xiàn)血管源性水腫，且腦水腫具有明顯惡化缺血性腦損傷病情的惡性影響[9]。本研究利用補(bǔ)腎益氣活血中藥作用大鼠，發(fā)現(xiàn)兩組大鼠濕腦組織中EB含量均表現(xiàn)為缺血再灌注1d內(nèi)迅速升高，3d內(nèi)達(dá)到最高值，以后呈減少趨勢(shì)，且在7d時(shí)仍明顯高于假手術(shù)組。說明補(bǔ)腎益氣活血中藥通過對(duì)血腦屏障功能的改善減輕血管源性腦水腫。有研究表明，VEGF在抗腦缺血損傷中起著刺激損傷部位血管形成、減弱缺血性損傷的重要作用[10，11]。VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原，在接受組織中氧含量變化的刺激后可做出應(yīng)激性反應(yīng)，調(diào)節(jié)損傷部位血管增生進(jìn)而改變供氧量。本研究中，病理切片顯色最深部分出現(xiàn)在腦組織缺血損傷壞死區(qū)域與正常腦組織交界處，說明此處為低氧區(qū)，刺激VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)，促進(jìn)血管增生、擴(kuò)張。但是VEGF在改變損傷部位缺血情況的同時(shí)也致使損傷部位出現(xiàn)了血漿外滲等情況[12]。中藥組大鼠濕腦組織中VEGF陽性細(xì)胞在同一時(shí)間點(diǎn)均僅微高于生理鹽水組，中藥在再灌注中VEGF 蛋白的表達(dá)沒有影響（P>0.05）。中藥正是利用對(duì)BBB的組織功能，減輕因腦缺血再灌注引起的血管源性腦水腫，進(jìn)而使肢體功能改善成為可能。

綜上所述，中藥組大鼠濕腦組織中EB含量在同一時(shí)間點(diǎn)均明顯低于生理鹽水組，證明了腦缺血再灌注損傷后VEGF不能介導(dǎo)血腦屏障破壞，對(duì)病變后血管源性腦水腫的發(fā)生無明顯作用。補(bǔ)腎益氣活血中藥是通過其改善血腦屏障的功能減輕血管源性腦水腫。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 周慶萍，陸建鋒，王會(huì)平，等. 銀杏葉提取物對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，39（4）：442-447.

[2] 周文祥，楊永麗，楊曉，等. PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路在腎小管上皮細(xì)胞缺血再灌注損傷中的調(diào)控作用及重組人紅細(xì)胞生成素預(yù)保護(hù)效應(yīng)[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，39（3）：314-320.

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[6] 楊德森，田先翔，李浩浩，等. 紅景天苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷抗氧化活性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（9）：2288-2290.

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[8] 殷雁，辛世萌. 丁苯酞預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2012，29（8）：715-718.

[9] 趙玉，包雪鸚. 亞血紅素多肽對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011，28（8）：721-723.

[10] 倪彩霞，曾南，湯奇，等. 芳香開竅藥對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠血腦屏障通透性的影響[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（11）：2639-2640.

[11] 鄭超波，江靜雯，殷衛(wèi)海，等. SIRT2對(duì)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011，28（11）：1002-1006.

[12] 劉斌，蔡梅芝，李愛華，等. 參芎化瘀膠囊對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（11）：229-232.

（收稿日期：2013-11-29）

（x±s，個(gè)/高倍視野，×400）

注：與同組上一時(shí)間點(diǎn)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P <0.05）；中藥組與同一時(shí)間點(diǎn)生理鹽水組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P>0.05）

3討論

腦缺血再灌注是造成缺血性腦血管病一個(gè)重要原因[5]。臨床上因?yàn)榛颊叱霈F(xiàn)血性腦血管病而引起一系列相應(yīng)的腦損傷病癥如Horner 征等往往是討論的一項(xiàng)重要課題。有研究報(bào)道，腦梗死等缺血性腦部病變患者的病情狀況與缺血腦組織中微血管密度程度及其動(dòng)態(tài)變化情況密切相關(guān)[6，7]。補(bǔ)腎益氣活血?jiǎng)t是臨床上一種極為常見的治療方法，其對(duì)VEGF的動(dòng)態(tài)變化和BBB通透性影響的研究具有重要意義[8]。

本研究顯示，腦缺血再灌注后BBB通透性的改變?yōu)橐粍?dòng)態(tài)變化過程。在缺血再灌注24h時(shí)，腦組織中EB含量已明顯高于假手術(shù)組。當(dāng)缺血再灌注72h后，腦組織中EB含量已達(dá)到峰值，且隨著時(shí)間推移，其濃度逐漸降低，直至7d時(shí)僅稍高于缺血再灌注24h時(shí)。血腦屏障的破壞導(dǎo)致腦部出現(xiàn)血管源性水腫，且腦水腫具有明顯惡化缺血性腦損傷病情的惡性影響[9]。本研究利用補(bǔ)腎益氣活血中藥作用大鼠，發(fā)現(xiàn)兩組大鼠濕腦組織中EB含量均表現(xiàn)為缺血再灌注1d內(nèi)迅速升高，3d內(nèi)達(dá)到最高值，以后呈減少趨勢(shì)，且在7d時(shí)仍明顯高于假手術(shù)組。說明補(bǔ)腎益氣活血中藥通過對(duì)血腦屏障功能的改善減輕血管源性腦水腫。有研究表明，VEGF在抗腦缺血損傷中起著刺激損傷部位血管形成、減弱缺血性損傷的重要作用[10，11]。VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原，在接受組織中氧含量變化的刺激后可做出應(yīng)激性反應(yīng)，調(diào)節(jié)損傷部位血管增生進(jìn)而改變供氧量。本研究中，病理切片顯色最深部分出現(xiàn)在腦組織缺血損傷壞死區(qū)域與正常腦組織交界處，說明此處為低氧區(qū)，刺激VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)，促進(jìn)血管增生、擴(kuò)張。但是VEGF在改變損傷部位缺血情況的同時(shí)也致使損傷部位出現(xiàn)了血漿外滲等情況[12]。中藥組大鼠濕腦組織中VEGF陽性細(xì)胞在同一時(shí)間點(diǎn)均僅微高于生理鹽水組，中藥在再灌注中VEGF 蛋白的表達(dá)沒有影響（P>0.05）。中藥正是利用對(duì)BBB的組織功能，減輕因腦缺血再灌注引起的血管源性腦水腫，進(jìn)而使肢體功能改善成為可能。

綜上所述，中藥組大鼠濕腦組織中EB含量在同一時(shí)間點(diǎn)均明顯低于生理鹽水組，證明了腦缺血再灌注損傷后VEGF不能介導(dǎo)血腦屏障破壞，對(duì)病變后血管源性腦水腫的發(fā)生無明顯作用。補(bǔ)腎益氣活血中藥是通過其改善血腦屏障的功能減輕血管源性腦水腫。

[參考文獻(xiàn)]

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[5] 吳常青，汪春彥，邵旭，等. 補(bǔ)陽還五湯有效部位對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制[J]. 中草藥，2011，42（1）：114-117.

[6] 楊德森，田先翔，李浩浩，等. 紅景天苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷抗氧化活性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（9）：2288-2290.

[7] 唐婧妹，裴清華. 三七總皂苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011， 17（15）：210-213.

[8] 殷雁，辛世萌. 丁苯酞預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2012，29（8）：715-718.

[9] 趙玉，包雪鸚. 亞血紅素多肽對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011，28（8）：721-723.

[10] 倪彩霞，曾南，湯奇，等. 芳香開竅藥對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠血腦屏障通透性的影響[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（11）：2639-2640.

[11] 鄭超波，江靜雯，殷衛(wèi)海，等. SIRT2對(duì)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011，28（11）：1002-1006.

[12] 劉斌，蔡梅芝，李愛華，等. 參芎化瘀膠囊對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（11）：229-232.

（收稿日期：2013-11-29）

（x±s，個(gè)/高倍視野，×400）

注：與同組上一時(shí)間點(diǎn)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P <0.05）；中藥組與同一時(shí)間點(diǎn)生理鹽水組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P>0.05）

3討論

腦缺血再灌注是造成缺血性腦血管病一個(gè)重要原因[5]。臨床上因?yàn)榛颊叱霈F(xiàn)血性腦血管病而引起一系列相應(yīng)的腦損傷病癥如Horner 征等往往是討論的一項(xiàng)重要課題。有研究報(bào)道，腦梗死等缺血性腦部病變患者的病情狀況與缺血腦組織中微血管密度程度及其動(dòng)態(tài)變化情況密切相關(guān)[6，7]。補(bǔ)腎益氣活血?jiǎng)t是臨床上一種極為常見的治療方法，其對(duì)VEGF的動(dòng)態(tài)變化和BBB通透性影響的研究具有重要意義[8]。

本研究顯示，腦缺血再灌注后BBB通透性的改變?yōu)橐粍?dòng)態(tài)變化過程。在缺血再灌注24h時(shí)，腦組織中EB含量已明顯高于假手術(shù)組。當(dāng)缺血再灌注72h后，腦組織中EB含量已達(dá)到峰值，且隨著時(shí)間推移，其濃度逐漸降低，直至7d時(shí)僅稍高于缺血再灌注24h時(shí)。血腦屏障的破壞導(dǎo)致腦部出現(xiàn)血管源性水腫，且腦水腫具有明顯惡化缺血性腦損傷病情的惡性影響[9]。本研究利用補(bǔ)腎益氣活血中藥作用大鼠，發(fā)現(xiàn)兩組大鼠濕腦組織中EB含量均表現(xiàn)為缺血再灌注1d內(nèi)迅速升高，3d內(nèi)達(dá)到最高值，以后呈減少趨勢(shì)，且在7d時(shí)仍明顯高于假手術(shù)組。說明補(bǔ)腎益氣活血中藥通過對(duì)血腦屏障功能的改善減輕血管源性腦水腫。有研究表明，VEGF在抗腦缺血損傷中起著刺激損傷部位血管形成、減弱缺血性損傷的重要作用[10，11]。VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原，在接受組織中氧含量變化的刺激后可做出應(yīng)激性反應(yīng)，調(diào)節(jié)損傷部位血管增生進(jìn)而改變供氧量。本研究中，病理切片顯色最深部分出現(xiàn)在腦組織缺血損傷壞死區(qū)域與正常腦組織交界處，說明此處為低氧區(qū)，刺激VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)，促進(jìn)血管增生、擴(kuò)張。但是VEGF在改變損傷部位缺血情況的同時(shí)也致使損傷部位出現(xiàn)了血漿外滲等情況[12]。中藥組大鼠濕腦組織中VEGF陽性細(xì)胞在同一時(shí)間點(diǎn)均僅微高于生理鹽水組，中藥在再灌注中VEGF 蛋白的表達(dá)沒有影響（P>0.05）。中藥正是利用對(duì)BBB的組織功能，減輕因腦缺血再灌注引起的血管源性腦水腫，進(jìn)而使肢體功能改善成為可能。

綜上所述，中藥組大鼠濕腦組織中EB含量在同一時(shí)間點(diǎn)均明顯低于生理鹽水組，證明了腦缺血再灌注損傷后VEGF不能介導(dǎo)血腦屏障破壞，對(duì)病變后血管源性腦水腫的發(fā)生無明顯作用。補(bǔ)腎益氣活血中藥是通過其改善血腦屏障的功能減輕血管源性腦水腫。

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（收稿日期：2013-11-29）