馬立利， 賈 麗， 周欣燃， 劉 艷＊， 范筱京， 潘燦平

（1.北京市理化分析測試中心，北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心，北京100089；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京100193）

生姜不僅是人們?nèi)粘ｏ嬍持须x不開的調(diào)味品，而且還具有開胃健脾、促進(jìn)食欲，防暑、降溫、提神，殺菌解毒、消腫止痛等醫(yī)用價(jià)值，在海外也深受歡迎［1］。但生姜中的農(nóng)藥殘留問題是廣大消費(fèi)者關(guān)注的熱點(diǎn)。從中國 WTO／TBT－SPS通報(bào)咨詢網(wǎng)公布的信息可知，自2006年5月29日日本實(shí)施《肯定列表制度》至2008年12月31日，日本厚生勞動省共扣留中國農(nóng)產(chǎn)品305批次，其中兩次在生姜中檢出了農(nóng)藥涕滅威。2007年，美國也發(fā)現(xiàn)進(jìn)口的中國生姜中涕滅威超標(biāo)。2013年5月，關(guān)于山東濰坊地區(qū)部分姜農(nóng)使用神農(nóng)丹（其主要成分為涕滅威）種姜的報(bào)道，引起了廣大消費(fèi)者的警惕，為此監(jiān)管部門開展了風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測。

涕滅威的化學(xué)名稱為O－甲基氨基甲酰基－2－甲基－2－甲硫基丙醛肟，它是一種高效、劇毒、廣譜、內(nèi)吸性的殺蟲、殺螨、殺線蟲劑。自1962年美國聯(lián)合碳化物公司開發(fā)出該產(chǎn)品以來，由于其高效、經(jīng)濟(jì)而被廣泛應(yīng)用于棉花、花生、玉米等多種作物以防治螨類、蚜蟲及線蟲等多種害蟲。涕滅威施入土壤后可迅速被氧化為相對穩(wěn)定且毒性更高的涕滅威亞砜（ASX），ASX又進(jìn)一步氧化為涕滅威砜（ASN）［2］。涕滅威和兩個(gè)主要代謝物都具有很高的水溶性和毒性。涕滅威及其亞砜在中性和偏酸性的水中穩(wěn)定，其降解半衰期可長達(dá)0.9～4.3年。因此，涕滅威一旦進(jìn)入地下水中便容易積累，造成對地下水的污染［3］。由于其較高的毒性，巴西、秘魯、美國等國家已經(jīng)全面禁止涕滅威的登記和使用。根據(jù)我國國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB2763－2012）［4］，生姜屬于根莖類蔬菜，其涕滅威的最大殘留限量為0.03 mg／kg。目前涕滅威的檢測方法主要為氣相色譜法［5，6］、液相色譜法［7］、液相色譜－質(zhì)譜法［2，8－15］。然而這些檢測方法的樣品前處理涉及多次提取、固相萃取凈化、衍生化等復(fù)雜的操作，無法滿足食品安全突發(fā)事件快速處置工作所需的快速、高效的要求。

QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）方法自發(fā)布以來，獲得了美國分析化學(xué)家協(xié)會（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）等多個(gè)國際分析機(jī)構(gòu)的認(rèn)可，已廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留的分析。目前，有文獻(xiàn)［16］報(bào)道將 QuEChERS方法中分散固相萃取步驟中的吸附劑裝填至固相萃取柱管內(nèi)進(jìn)行樣品處理同樣能夠達(dá)到凈化的目的。此類萃取柱為濾過型凈化柱（multiplug filtration clean－up，m－PFC），其 原 理 也 是 提 取 溶 劑中的樣品基質(zhì)與吸附劑發(fā)生作用。在m－PFC中，其吸附劑主要用于吸附基質(zhì)中的干擾物質(zhì)而不是目標(biāo)物，所以凈化柱中吸附劑的含量會影響回收率和凈化效果。m－PFC方法相比分散固相萃取，不需要稱量吸附劑，可以大大縮短凈化時(shí)間，從而提高工作效率。Zhao等［17，18］利 用 m－PFC 凈 化 技 術(shù) 分 別 建 立 了 蘋果、卷心菜、馬鈴薯中4 0種農(nóng)藥，以及番茄、番茄汁、番茄醬中1 8 6種農(nóng)藥的分析方法。該類方法快速、高效，可以充分滿足食品安全突發(fā)事件中對農(nóng)藥多殘留的檢測要求。本研究的目的是利用m－PFC和超高效液相色譜／串聯(lián)質(zhì)譜建立一種高效、靈敏的生姜中涕滅威及其代謝物的檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC－ESI－MS／MS系統(tǒng)配有 ACQUITY 超高效液相色譜儀、Xevo TQ－S串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；渦旋儀（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；Elix 10 Milli－Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）；恒溫水浴氮吹儀，包括 N－EVAPTM112氮?dú)庹舭l(fā)儀、OA－SYSTM加熱裝置（美國Organomation Associates公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm；Waters公司）；0.22μm微孔濾膜（天津津騰科技有限公司）。

涕滅威（aldicarb）、涕滅威砜（aldicarb sulfone）、涕滅威亞砜（aldicarb sulfoxide）標(biāo)準(zhǔn)品購于 Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，購自Fisher公司。

多壁碳納米管m－PFC凈化柱購于天津博納艾杰爾科技有限公司，內(nèi)有10 mg多壁碳納米管（外徑10～20 nm，內(nèi)徑5 nm）和150 mg無水硫酸鎂。

1.2 樣品處理

1.2.1 樣品提取

稱取5 g（精確至0.01 g）已粉碎的生姜樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋1 min；加入0.5 g氯化鈉和2 g無水硫酸鎂后迅速劇烈搖動混勻，于冰水浴中靜置5 min，在4℃、5 000 r／min下離心5 min。取1 mL上清液至2 mL塑料離心管中，待凈化。

1.2.2 樣品凈化

濾過型凈化柱的示意圖見圖1，其中的填料為10 mg多壁碳納米管和150 mg無水硫酸鎂。m－PFC的凈化操作步驟如圖2所示。將注射器與濾過型凈化柱連接，向上抽，使所有液體經(jīng)過凈化柱，再推出至離心管中，樣品提取液第二次經(jīng)過吸附劑部分。重復(fù)操作一次。凈化液于50℃下用氮?dú)獯蹈桑靡译妫?∶95，v／v）溶解并定容至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜后待測定。

圖1 濾過型凈化柱示意圖Fig.1 Schematic diagram of an m－PFC tip

圖2 m－PFC凈化操作步驟（凈化1次）Fig.2 Schematic diagram of the rapid m－PFC method at one time clean－up

1.3 儀器分析條件

1.3.1 色譜條件

柱溫：30℃；流速：0.2 mL／min；進(jìn)樣量：5.0μL；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～3 min，95%B；3～7.5 min，95%B～20%B；7.5～9 min，20%B～95%B；9～11 min，95%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子電離（ESI＋）；源溫度150℃；毛細(xì)管電壓3.2 kV；脫溶劑溫度500℃；脫溶劑氣（氮?dú)猓┝髁?00 L／h。3種目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 涕滅威及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of aldicarb and its metabolites

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜與色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 定容溶劑的優(yōu)化

用氮?dú)獯蹈蓛艋海砸译嫒芙舛ㄈ莺筮M(jìn)行儀器分析時(shí)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物的峰形都較差。因此考察了以不同體積比（50∶50、20∶80、10∶90、5∶95）的乙腈－水和乙腈－0.1%甲酸水溶液為定容溶劑時(shí)目標(biāo)物的響應(yīng)值和峰形。結(jié)果表明，定容溶劑中加酸不能明顯改善峰形和響應(yīng)值。而隨著定容溶劑中水的比例增加，目標(biāo)物的峰形有顯著改善，為10∶90和5∶95時(shí)沒有明顯的區(qū)別。而初始流動相為乙腈－水（5∶95）時(shí)，目標(biāo)物的分離效果良好（見圖3），因此以初始流動相為定容溶劑。

圖3 涕滅威及其代謝物的色譜圖Fig.3 Chromatogram of aldicarb and its metabolites

2.1.2 質(zhì)譜條件的確定

首先在正離子檢測方式下分別對100μg／L 3種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析得到分子離子峰和碎片離子峰，從而選定母離子和子離子。其中涕滅威砜和涕滅威亞砜的母離子為［M＋H］＋，涕滅威為［M＋NH4］＋。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化了監(jiān)測離子、錐孔電壓及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)（見表1）。在最優(yōu)條件下，目標(biāo)物得到良好分離，靈敏度高，符合農(nóng)藥殘留檢測的要求。

2.2 提取與凈化條件的優(yōu)化

2.2.1 提取條件的優(yōu)化

為了評價(jià)不同溶劑對目標(biāo)物提取效率的影響，本文分別以甲醇和乙腈為提取溶劑對生姜中添加的涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜3種目標(biāo)物進(jìn)行提取。結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑時(shí)凈化柱的柱壓太大，無法順利將1.0 mL樣品溶液吸進(jìn)凈化柱內(nèi)，因此選用乙腈為提取溶劑。

2.2.2 凈化次數(shù)的優(yōu)化

m－PFC中凈化次數(shù)對凈化效果有一定的影響。分別比較了凈化0、1、2、3次后基質(zhì)樣品的顏色。結(jié)果表明，經(jīng)過1、2、3次凈化的提取液的顏色明顯比未凈化的提取液的顏色淺，但凈化1、2、3次的提取液的顏色之間無明顯區(qū)別（見圖4），表明m－PFC凈化柱對色素具有較好的吸附去除效果。

圖4 不同凈化次數(shù)基質(zhì)樣品的顏色Fig.4 Effect of clean－up times on color of the extract

在生姜空白樣品中添加200μg／kg的目標(biāo)物進(jìn)行不同凈化次數(shù)的考察，每個(gè)凈化次數(shù)重復(fù)測定6次。結(jié)果表明，凈化1、2、3次，涕滅威和涕滅威亞砜的回收率沒有明顯區(qū)別，但凈化2次的回收率的RSD最小；而凈化2次時(shí)涕滅威砜的回收率最高（見圖5）。綜合考慮，本文選擇凈化2次。

2.3 分析方法的評價(jià)

采用空白基質(zhì)溶液配制系列質(zhì)量濃度（0.5、1、5、10、50、100、200μg／L）的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，3種目標(biāo)物的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，3種農(nóng)藥的響應(yīng)值和濃度均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)大于0.99。

圖5 不同凈化次數(shù)對目標(biāo)物回收率的影響Fig.5 Effect of clean－up time on the recoveries of the analytes

表2 3種目標(biāo)物的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations and correlation coefficients（r2）of the analytes

本文以每種目標(biāo)物信噪比（S／N）為3時(shí)對應(yīng)的樣品中目標(biāo)物的添加濃度為本方法的檢出限（LOD），涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜分別為0.3、0.6、0.3μg／kg；以每種目標(biāo)物信噪比為10時(shí)的添加濃度確定為本方法的定量限（LOQ），涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜分別為1.0、2.0、1.0μg／kg。

將生姜空白樣品攪碎稱量后，添加2、20、200 μg／kg目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并靜置30 min，目標(biāo)物被樣品充分吸收后，按照前述方法進(jìn)行提取、凈化和測定，每個(gè)水平做6次平行試驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度。結(jié)果表明，生姜基質(zhì)中涕滅威的回收率為80.3%～89.8%，RSD為0.7%～10.4%；涕滅威砜為71.4%～76.9%，RSD為9.9%～13.2%；涕滅威亞砜為77.3%～84.5%，RSD為3.3%～11.8%（見表3）。

表3 生姜空白樣品中目標(biāo)物的加標(biāo)回收率和RSD（n＝6）Table 3 Recoveries and RSDs of target analytes spiked in blank ginger（n＝6）

2.4 樣品分析

應(yīng)用本方法對市售的10個(gè)生姜樣品進(jìn)行測定，均未檢出涕滅威、涕滅威砜和涕滅威亞砜。

3 結(jié)論

本文建立了生姜中涕滅威及其代謝物的超高效液相色譜／串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。采用乙腈提取，多壁碳納米管濾過型凈化柱凈化。濾過型凈化柱操作簡單，可以大大縮短凈化時(shí)間；所用超高效液相色譜技術(shù)具有高通量樣品分析的能力。本方法快速、高效，可以充分滿足食品安全突發(fā)事件中對生姜中涕滅威及其代謝物殘留的檢測要求。

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