張 毅，周凌云，虞 昊

(1.南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 南通 226001；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院針灸科，黑龍江 哈爾濱 150001)

·論 著·

展神經(jīng)損傷后神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)再生的研究

張 毅1，周凌云2，虞 昊1

(1.南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 南通 226001；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院針灸科，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的探討展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)再生的情況。方法選用健康雄性Beagle犬4只，經(jīng)顳底入路顯微手術(shù)，解剖、暴露展神經(jīng)腦池段行展神經(jīng)切斷，并測定展神經(jīng)功能。術(shù)后連續(xù)7 d靜脈注射BrdU，術(shù)后28 d灌注取材，犬腦行冠狀位冰凍切片。行nestin/BrdU、DCX/BrdU、GFAP/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測。結(jié)果Beagle犬眼球呈內(nèi)斜視，損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)可見nestin/BrdU陽性神經(jīng)前體細(xì)胞，DCX/BrdU陽性新生神經(jīng)元前體細(xì)胞以及GFAP/BrdU陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞。對(duì)側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)未見相關(guān)陽性細(xì)胞。結(jié)論展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)再生現(xiàn)象。

展神經(jīng)損傷；展神經(jīng)核；神經(jīng)再生

展神經(jīng)為第Ⅵ對(duì)腦神經(jīng)，全程走行復(fù)雜，經(jīng)過并毗鄰許多重要結(jié)構(gòu)，如Dorello管、海綿竇、眶上裂等，與頸內(nèi)動(dòng)脈、交感神經(jīng)、Gruber韌帶、巖下竇等結(jié)構(gòu)聯(lián)系密切。顱內(nèi)炎癥、腫瘤、外傷、顱內(nèi)高壓、眼部病變常導(dǎo)致展神經(jīng)損傷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。以往認(rèn)為腦神經(jīng)損傷后不能再生[1]，但近年來眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)一些腦神經(jīng)損傷后也有再生現(xiàn)象[2-4]。本文對(duì)展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內(nèi)是否有神經(jīng)再生現(xiàn)象進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Beagle犬4只(南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場提供)，年齡1～2歲，體重10～20 kg，體長70～100 cm。許可證號(hào)：SCXK(蘇)：2008-0010。每只籠內(nèi)最多飼養(yǎng)1只，實(shí)驗(yàn)前、后在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)。

1.2 展神經(jīng)損傷模型制備 術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)麻醉。將Beagle犬置于側(cè)臥位，頭向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)，頭部置于頭圈上，耳緣牽向中線和尾側(cè)。常規(guī)消毒、鋪巾，開顱皮瓣翻向外側(cè)并縫線固定。于顳肌附著處切開顳肌，在顳骨上保留一小片顳肌附著緣，以便關(guān)顱時(shí)縫合。顳底入路開顱，骨窗要盡量靠近顱底，用高速梅花鉆和顯微咬骨鉗形成從眶后到顴弓前足夠大骨窗，擴(kuò)大約3.0 cm×3.0 cm(圖1)，即可沿骨窗下緣切開硬膜并放射狀剪開。通過向內(nèi)、上方牽拉顳葉牽開腦組織，磨除巖骨前部，可見深部的展神經(jīng)(圖2)，穿過腦橋前池，在神經(jīng)切斷后應(yīng)用雙極電凝處理神經(jīng)斷端，并將近側(cè)端翻向腦干方，術(shù)中給予生理鹽水500 ml+慶大霉素16萬U靜脈滴注，術(shù)后當(dāng)天開始連續(xù)3 d肌肉注射青霉素160萬U。保證實(shí)驗(yàn)室溫度在25℃左右，術(shù)中注意動(dòng)物保暖。

1.3 BrdU靜脈注射 術(shù)后每條犬靜脈注射BrdU 50 mg/kg，2次/d(早7時(shí)和晚7時(shí))，連續(xù)7 d。

1.4 組織固定及切片 術(shù)后28 d犬麻醉后，開胸經(jīng)心灌注生理鹽水及含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS(pH 7.2)，取腦后固定6 h。再分別經(jīng)20%、30%蔗糖平衡，行冠狀位冰凍連續(xù)切片，片厚20μm。共收集各犬展神經(jīng)核部位前、中、后3套切片，均貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上待染色。

圖1 顳底入路骨窗

圖2 展神經(jīng)(箭頭示)

圖3 展神經(jīng)損傷后眼球位置

圖4 Nestin（綠）/BrdU（紅）免疫熒光雙標(biāo)檢測損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞。損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)Nestin/BrdU免疫熒光陽性神經(jīng)前體細(xì)胞（箭頭）

圖5 DCX（綠）/BrdU（紅）免疫熒光雙標(biāo)檢測損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)新生神經(jīng)元前體細(xì)胞。損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)DCX/BrdU免疫熒光陽性新生神經(jīng)元前體細(xì)胞（箭頭）

圖6 GFAP（綠）/BrdU（紅）免疫熒光雙標(biāo)檢測損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)新生星形膠質(zhì)細(xì)胞，損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)GFAP/BrdU免疫熒光陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞（箭頭）

1.5 免疫熒光 取上述切片，用0.01 mol/L PBS (pH 7.2)漂洗后，每張切片滴加10%山羊血清50 μl封閉過夜，然后用一抗孵育：兔抗-BrdU(1:100，Abcam)、鼠抗-nestin(1:2000，Millipore)、豚鼠抗DCX(1:1000，Millipore)、鼠抗-GFAP(1:500，Millipore)，4℃濕盒孵育24 h，用0.01 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗3遍，在避光條件下，用二抗孵育：結(jié)合有Alexa Fluor 594的羊抗兔二抗(1:1000，Molecular Probes)、結(jié)合有Alexa Fluor 488的羊抗鼠或豚鼠的二抗(1:200，invitrogen)4℃濕盒孵育24 h，在避光條件下，PBS洗片3遍后中性甘油封片。熒光顯微鏡下觀察陽性的免疫熒光細(xì)胞并攝片。

2 結(jié) 果

2.1 展神經(jīng)損傷后功能測定 所有存活Beagle犬術(shù)后均生存良好，無感染、角膜潰瘍等并發(fā)癥，展神經(jīng)切斷后，損傷后犬眼球始終呈內(nèi)斜視(圖3)，無其他神經(jīng)功能障礙征象。

2.2 免疫熒光檢測

2.2.1 Nestin/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測 術(shù)后28 d，對(duì)雙側(cè)展神經(jīng)核進(jìn)行nestin/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測，損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)可見到nestin/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性神經(jīng)前體細(xì)胞(圖4)，而對(duì)側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)未見到nestin/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性神經(jīng)前體細(xì)胞。展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)了具有再生潛能的神經(jīng)前體細(xì)胞。

2.2.2 DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測 術(shù)后28 d，對(duì)雙側(cè)展神經(jīng)核進(jìn)行DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測，損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)可見DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性新生神經(jīng)元前體細(xì)胞(圖5)，而對(duì)側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)未見到DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性細(xì)胞。展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)的神經(jīng)前體細(xì)胞，可能具有向神經(jīng)元分化的能力。

2.2.3 GFAP/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測 術(shù)后28 d，對(duì)雙側(cè)展神經(jīng)核進(jìn)行GFAP/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測，損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)可見GFAP/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性的新生星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖6)，而對(duì)側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)未見到GFAP/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性細(xì)胞。這一部分的陽性細(xì)胞可能是損傷后膠質(zhì)增生而來，也可能是展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)的神經(jīng)前體細(xì)胞分化而來。

3 討 論

顱腦神經(jīng)損傷比較常見，除原發(fā)自顱神經(jīng)的病變外，顱骨及腦內(nèi)病變，眼部病變也多侵及腦神經(jīng)，如海綿竇內(nèi)病變或直接手術(shù)的腦神經(jīng)損傷發(fā)生率高達(dá)22%～61%[5]。腦神經(jīng)主要位于顱內(nèi)深部，經(jīng)顱底多個(gè)孔裂進(jìn)出顱腔，除與腦干連接處外，整段腦神經(jīng)均走行在蛛網(wǎng)膜下腔的腦脊液(CSF)內(nèi)，未被其他組織支持包繞，故其抵抗?fàn)坷蜋C(jī)械外力的能力遜于其他周圍神經(jīng)。另外，顱神經(jīng)的血供較單一，主要來自軟腦膜上的動(dòng)脈，且多與腦重要功能區(qū)、主要?jiǎng)?、靜脈關(guān)系密切；CSF內(nèi)的代謝終產(chǎn)物、炎細(xì)胞及CSF對(duì)斷裂神經(jīng)遠(yuǎn)端分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子的稀釋作用均給損傷后修復(fù)帶來較大障礙。

腦神經(jīng)損傷處與神經(jīng)元胞體的距離非常接近，一般在數(shù)厘米左右[6-7]。有研究表明，神經(jīng)損傷處與神經(jīng)元胞體的距離和軸突再生能力呈負(fù)相關(guān)，此點(diǎn)也是腦神經(jīng)再生修復(fù)能力明顯低于其他周圍神經(jīng)的重要原因[8]。諸多學(xué)者已經(jīng)展開相關(guān)腦神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)研究工作，并且認(rèn)為腦神經(jīng)損傷后具有一定的自我再生能力[2-4]。

展神經(jīng)組織學(xué)由于缺乏神經(jīng)外膜、基底膜和牢固的神經(jīng)束膜包被，僅被1～2層髓鞘細(xì)胞包繞，膠原蛋白含量明顯低于其他周圍神經(jīng)，且缺少用于連接神經(jīng)束的結(jié)締組織，給修復(fù)和重建帶來一定困難[6-7]。那么展神經(jīng)損傷后是否也具有一定自我再生修復(fù)能力則未見報(bào)道。本研究觀察到，犬展神經(jīng)損傷后28 d，損傷側(cè)展展神經(jīng)核內(nèi)有nestin/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性神經(jīng)前體細(xì)胞，而且有新生的DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性神經(jīng)元前體細(xì)胞以及GFAP/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞。說明展神經(jīng)損傷后，具有一定的自我再生的能力，出現(xiàn)的神經(jīng)前體細(xì)胞能夠向神經(jīng)元以及星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。這些新生的細(xì)胞可能參與了展神經(jīng)的再生過程。

神經(jīng)再生過程復(fù)雜，涉及的因素眾多，如何提高展神經(jīng)損傷后自我再生的能力以助于展神經(jīng)的修復(fù)有待于我們今后進(jìn)一步研究。

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[4]楊 敏,孟佑強(qiáng),朱寧喜,等.動(dòng)眼神經(jīng)損傷后中腦動(dòng)眼神經(jīng)核新生神經(jīng)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華神經(jīng)外科雜志,2010,26(3): 281-282.

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[8]Dubuisson A,Kline DG.Indications for peripheral nerve and brachial plexus surgery[J].Neurol Clin,1992,10(4):935-951.

Study of the neural regeneration in the abducens nucleus after abducens nerve injury.

Z HANG Yi1,ZHOU Ling-yun2,YU Hao1.
1.Department of Neurosurgery,Second Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong, 226001,Jiangsu,CHINA;2.Department of Acupuncture,the First Affliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,Heilongjiang,CHINA

ObjectiveTo explore the neural regeneration in the abducens nucleus after abducens nerve injury.MethodsFour healthy male Beagle dogs were selected and subtemporal approach was adopted.By using microsurgery to expose the cisternal segment of the abducens nerve,the abducens nerve was cut and function test was measured.Dogs were injected with BrdU at 1 to 7 days post-injury to allow identification of differentiated cells and sacrificed at 28 days for immunofluorescence of nestin/BrdU,DCX/BrdU,GFAP/BrdU.ResultsOcular motility disorders caused by abducens nerves injury emerged in the injured eye of Beagle dogs.Nestin/BrdU double positive neural progenitor cells,DCX/BrdU double positive newborn neuronal progenitor cells and GFAP/BrdU double positive newborn astrocytes were found in the abducens nucleus after abducens nerve injury.Conclusion Neural regeneration occurred in the abducens nucleus of Beagle dogs with abducens nerve injury.

Abducens nerve injury;Abducens nucleus;Neural regeneration

R-332

A

1003—6350（2014）09—1249—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.09.0486

2014-02-12)

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：ZD201211)；南通市社會(huì)事業(yè)科技創(chuàng)新與示范計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：HS2012031)

張 毅。E-mail:zhangyi9285@sina.com