楊小秋，羅文匯，董玉娟，彭麗詩(shī),許燦新

(1.深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院，廣東 深圳 518055；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405)

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厚樸四君子湯顆粒的HPLC指紋圖譜及其與組方藥材的相關(guān)性研究

楊小秋1，羅文匯2*，董玉娟3，彭麗詩(shī)3,許燦新3

(1.深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院，廣東 深圳 518055；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405)

目的：建立厚樸四君子湯顆粒的指紋圖譜，為該制劑的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：采用高效液相色譜法，以SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6mm×250mm，5μm) 為色譜柱；以甲醇 (A)-0.1%(體積分?jǐn)?shù))磷酸(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)240nm；流速1.0mL·min-1；柱溫30℃,建立厚樸四君子湯顆粒的HPLC指紋圖譜共有模式，并對(duì)色譜峰進(jìn)行歸屬分析。結(jié)果：確定了24個(gè)共有峰，10批樣品相似度均在0.9以上，其中20個(gè)色譜峰分別溯源到厚樸、人參、白術(shù)、茯苓和甘草五味藥材，4個(gè)色譜峰可明確化學(xué)成分的歸屬。結(jié)論：該實(shí)驗(yàn)建立的HPLC指紋圖譜體現(xiàn)了厚樸四君子湯顆粒的整體特征，能有效地對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

厚樸四君子湯顆粒；指紋圖譜；高效液相色譜

厚樸四君子湯由厚樸加四君子湯組成?！八木訙睘椤短交菝窈蛣┚址健返慕?jīng)典方，由人參、茯苓、白術(shù)、甘草組成，具有補(bǔ)氣、健脾、利濕之功效，是中醫(yī)治療脾胃氣虛、運(yùn)化無(wú)力的常用方劑，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用于慢性胃炎、胃及十二指腸球部潰瘍等屬脾胃氣虛型疾病的治療[1]。根據(jù)臨床常見(jiàn)慢性胃炎患者大多有食積氣滯、脘腹脹悶或腹痛、泄瀉等的癥狀，在“四君子湯”的基礎(chǔ)上加具有行氣化濕、溫中止痛的厚樸，稱之為“厚樸四君子湯”。厚樸四君子湯顆粒具有行氣化濕止痛、益氣健脾之功效，現(xiàn)代臨床多用于治療慢性胃炎、胃及十二指腸球部潰瘍等屬脾胃氣滯、氣虛證。

本研究在前期探討了厚樸四君子湯治療慢性胃炎的藥效作用[2]，為了更好地控制厚樸四君子湯顆粒的質(zhì)量，采用高效液相色譜法構(gòu)建厚樸四君子湯及各單味藥指紋圖譜，并對(duì)組方藥材與顆粒之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)色譜峰進(jìn)行歸屬，以期為厚樸四君子湯的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695-2998型高效液相色譜儀(美國(guó)沃特斯公司，PAD檢測(cè)器，四元梯度泵)，軟件為Empower 2 數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)；SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6 mm×250 mm，5μm) 色譜柱；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Mettler XS205DU 電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；MilliPoreAdvantage A10 自動(dòng)純水機(jī)(美國(guó)默克密理博公司)。

1.2 試藥

厚樸四君子湯顆粒由深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院提供，批號(hào)見(jiàn)表1。厚樸、人參、茯苓、白術(shù)、甘草藥材均購(gòu)于安徽廣印堂制藥有限公司，經(jīng)劉法錦研究員鑒定：厚樸為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮；人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖；白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖；茯苓為多孔菌科茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核；甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖。甘草苷對(duì)照品(批號(hào)：111610-201005)、甘草酸銨(批號(hào)：110731-200615)、厚樸酚(批號(hào)：729-9204)、和厚樸酚(批號(hào)：730-9204)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)默克公司)；液相用水為超純水；其余試劑均為分析純。

表1 厚樸四君子湯顆粒測(cè)試樣品批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6mm×250mm，5μm) ；流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相A，0.1%(體積分?jǐn)?shù))磷酸的水溶液為流動(dòng)相B，按表2程序，進(jìn)樣測(cè)定。檢測(cè)波長(zhǎng)：240nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.2 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取甘草苷、甘草酸銨、厚樸酚和和厚樸酚對(duì)照品適量，置100mL容量瓶中，加甲醇分別制成每1mL含甘草苷0.101mg、甘草酸銨0.1664mg、厚樸酚0.5378mg和和厚樸酚0.6012mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

分別取上述S1～S10厚樸四君子湯顆粒各約2.0g，精密稱定，置100mL具塞錐瓶中，精密加入50%甲醇25mL，稱定重量，超聲處理(功率200W，頻率40kHz)30min。取出，放冷，再稱定重量，加50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 厚樸四君子湯顆粒組方藥材供試品溶液制備

分別取與顆粒投料同批藥材，厚樸藥材粉末1.5g、人參藥材粉末3.0g、白術(shù)藥材粉末2.0g、茯苓藥材粉末5.0g、甘草0.5g，精密稱定，加水100mL，煮沸30min，蒸干，加硅藻土1.0g拌勻，同“2.3”項(xiàng)方法制成厚樸四君子湯顆粒組方藥材供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一批厚樸四君子湯顆粒(批號(hào)：J130805)，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。以9號(hào)峰為參照峰，其保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其RSD值均小于3%，同時(shí)用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算各指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批厚樸四君子湯顆粒(批號(hào)：J130805)，分別精密稱取6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。以9號(hào)峰為參照峰，其保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，同時(shí)用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算各指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批厚樸四君子湯顆粒(批號(hào)：J130805)，分別于制備后0、4、8、12、16、24h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。以9號(hào)峰為參照峰，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，同時(shí)用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算各色譜指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 厚樸四君子湯顆粒HPLC指紋圖譜的建立

2.6.1 厚樸四君子湯顆粒對(duì)照指紋圖譜的建立及特征峰的指認(rèn) 采用藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)對(duì)10批厚樸四君子湯顆粒HPLC圖譜進(jìn)行處理，匹配結(jié)果見(jiàn)圖1，所得對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖2。選擇穩(wěn)定性好、吸收較強(qiáng)、特征明顯的色譜峰為共有峰，根據(jù)10批樣品的測(cè)定結(jié)果確定24個(gè)共有峰。經(jīng)與對(duì)照品溶液色譜圖比對(duì)后，確認(rèn)樣品圖譜中10號(hào)峰為甘草苷、22號(hào)峰為甘草酸銨、23號(hào)峰為和厚樸酚和24號(hào)峰為厚樸酚。9號(hào)峰峰面積大小適中，基線分離，以9號(hào)峰為參照峰，其保留時(shí)間和峰面積為1，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積分別列于表3、表4。10批厚樸四君子湯顆粒與對(duì)照指紋圖譜相似度分別為：0.981、0.973、0.980、0.962、0.973、0.984、0.986、0.975、0.901、0.991。各批厚樸四君子湯顆粒與對(duì)照指紋圖譜的相似度均較高，為了保證厚樸四君子湯顆粒的質(zhì)量，按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)計(jì)算，應(yīng)規(guī)定供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度不得低于0.90。

圖1 10批厚樸四君子湯顆粒色譜匹配圖譜

圖2 厚樸四君子湯顆粒的HPLC圖譜

注：A對(duì)照指紋圖譜，B對(duì)照品色譜；10甘草苷、22甘草酸銨、23和厚樸酚、24厚樸酚

表3 10批厚樸四君子湯顆粒指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

續(xù)表3 10批厚樸四君子湯顆粒指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表4 10批厚樸四君子湯顆粒指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

2.6.2 復(fù)方與藥材相關(guān)性研究 采用相同色譜條件測(cè)定各藥材及復(fù)方指紋圖譜，通過(guò)各色譜峰保留時(shí)間的比較分析，歸屬了 20個(gè)特征峰，其中5、6、7、8、9、18、19、23、24號(hào)峰來(lái)源于厚樸，10、11、12、14、15、16、21、22號(hào)峰來(lái)源于甘草，1、19號(hào)峰來(lái)源于厚樸和白術(shù)，2、4號(hào)峰來(lái)源于人參和茯苓，見(jiàn)圖4。3、13、17、20號(hào)峰不屬于任何單味藥，推斷其為厚樸四君子湯經(jīng)水煎煮過(guò)程中的化合產(chǎn)物。

3 討論

考察不同流動(dòng)相體系、檢測(cè)波長(zhǎng)和供試品溶液的制備方法，結(jié)果顯示以甲醇-0.1%磷酸為流動(dòng)相體系梯度洗脫所得到的色譜圖基線較平穩(wěn)且分離效果好；檢測(cè)波長(zhǎng)在240nm測(cè)定，特征峰數(shù)多且響應(yīng)靈敏度高；以50%甲醇超聲30min，所得色譜圖最大限度地反映了顆粒的特征。

圖4 厚樸四君子湯與其各單味藥HPLC指紋圖譜

注：A厚樸四君子湯顆粒；B厚樸藥材;C人參藥材;D白術(shù)藥材;E茯苓藥材；F甘草藥材

中藥復(fù)方制劑的多指標(biāo)定量分析是目前質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，其根本原因在于可供定量用的對(duì)照品有限[3]。中藥指紋圖譜是一種綜合性、可量化的鑒定手段，主要用于評(píng)價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，為中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供方法學(xué)平臺(tái)。建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)，這也正好符合中醫(yī)理論的整體學(xué)說(shuō)。[4]

本研究建立了厚樸四君子湯顆粒的HPLC指紋圖譜，此方法簡(jiǎn)便、可靠、重現(xiàn)性好，為后續(xù)厚樸四君子湯顆粒藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的深入開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。以9號(hào)峰為參照峰確定了厚樸四君子湯顆粒的24個(gè)共有峰，并通過(guò)相似度計(jì)算軟件得到10批厚樸四君子湯顆粒的對(duì)照指紋圖譜及各批樣品與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度，結(jié)果10批樣品相似度均在0.9以上。不同批號(hào)厚樸四君子湯顆粒指紋圖譜的色譜峰整體上基本一致，表明厚樸四君子湯顆粒提取工藝及制劑工藝都比較穩(wěn)定，對(duì)原料藥材的質(zhì)量控制良好，保證了厚樸四君子湯顆粒質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性，可以滿足生產(chǎn)的需要。本文所建立的HPLC指紋圖譜可有效控制厚樸四君子湯顆粒的質(zhì)量，同時(shí)研究結(jié)果顯示，厚樸四君子湯合煎后產(chǎn)生了各單味藥獨(dú)立水煎所不具有的新成分，提示復(fù)方水煎液所含藥物化學(xué)成分不等同于各單味藥藥物化學(xué)成分的簡(jiǎn)單加合，從藥物化學(xué)的層面，再次驗(yàn)證了“藥有個(gè)性之所長(zhǎng)，方有合群之妙用”的古訓(xùn)[5]。

[1] 高永珍,武瑞珍,陳永利.四君子湯在中醫(yī)內(nèi)科疾病脾胃氣虛證中的應(yīng)用[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥,2013(05):52.

[2] 曾國(guó)慶,楊小秋,付英玉.厚樸四君子湯治療慢性胃炎療效觀察[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2012,7(34):128-129.

[3] 羅文,劉斌,王偉,等.基于降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位HPLC指紋圖譜的多指標(biāo)成分定量方法研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,33(6):413.

[4] 孫響波,于妮娜,張法榮.黑地黃丸及其各單味藥HPLC指紋圖譜研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,1(16):64-65.

[5] 孫志翠,裴強(qiáng)偉,王欣，等.酸棗仁湯及其各單味藥HPLC 指紋圖譜研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2013,40(5):988-989.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

HPLC Fingerprint of Houpo Sijun Decoction Granules and Correlativity with Its Relevant Herbs

Yang Xiaoqiu1,Luo Wenhui2,Dong Yujuan3,Peng Lishi3,Xu Cangxin3

(1. Nanshan District Xili People's Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518055, China; 2.Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of Chinese Medicine, Guangzhou 510095, China; 3.Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

Objective:To establish the HPLC fingerprint of traditional Chinese medicines Houpo Sijun Decoction Granules and provide experimental basis for the quality control.Methods:The analytical column was SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6mm×250mm，5μm).Gradient elution was used with mobile phase consisting of methanol-0.1% phosphoric. The detective wavelength was set at 240nm. The flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was maintained at 30℃. Establish the characteristic mode of HPLC fingerprint and the correlativity between fingerprint peaks of Houpo Sijun Decoction Granules and its component herbs was analyzed．Results:The HPLC fingerprint consisted of 24 common peaks，among which 20 peaks were assigned by parallel comparison with the fingerprints of Magnolia officinalis，Panax ginseng，Atractylodes macrocephala, Poria cocos,and Glycyrrhiza uralensis,and 4 peaks were identified by comparison with the chemical reference substances.Conclusion:The established HPLC fingerprint reflects the general character of Houpo Sijun Decoction Granules. It can be used as a quality control method for Houpo Sijun Decoction Granules.

Houpo Sijun Decoction Granules; Fingerprint; HPLC

2014-03-21

廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目(20121044)

楊小秋(1963-), 男，廣東省深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院副主任中藥師,研究方向中藥學(xué)。

羅文匯(1980-)，男，廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院副主任中藥師,研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量評(píng)價(jià)。

R284.1

A

1673-2197(2014)13-0014-05