邱盼子，肖作奇，潘 濤，黃 懿，黃 濤，歐陽波

（湖南省婦幼保健院，湖南 長沙 410008）

陰炎凈洗液是湖南省婦幼保健院臨床應(yīng)用二十余年的中醫(yī)婦科制劑，由黃連、黃柏、苦參、蒲公英、龍膽、連翹、地膚子等9味中藥材配伍而成。全方組成結(jié)構(gòu)嚴謹，黃連、黃柏均具有瀉火燥濕、解毒殺蟲之功效，二者同用，共清中下焦之濕熱，共為方中君藥[1-5]；苦參，大苦大寒，退熱泄降，蕩滌濕火，其燥尤烈，故能殺濕熱所生之蟲，為方中臣藥[6-8]；并佐以其余6味清熱燥濕藥，具有清熱解毒、消炎止痛、殺蟲止癢、消腫止痛之功效[9-18]，主要用于霉菌、滴蟲及細菌引起的陰道炎、宮頸炎、外陰瘙癢、濕疹及淋病的輔助治療。

2015年版《中華人民共和國藥典》僅采用個別指征性成分的含量來對中藥材或中藥制劑進行質(zhì)量控制，但中藥是以多成分作為一個整體來發(fā)揮藥效的，僅對幾個成分進行定性或定量控制難以全面評價中藥材或中藥制劑的質(zhì)量特征?；谥兴幷w質(zhì)量控制觀，本研究選用10批陰炎凈洗液中藥飲片制備陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑，采用HPLC-DAD法建立了標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，并對13種主要成分進行了指認，可為陰炎凈洗液的整體質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent HP 1260型HPLC儀，包括G13222在線脫氣機、G1312B二元泵、G1316A柱溫箱、G1379B DAD檢測器、Agilent Open Lab化學(xué)工作站（美國Agilent公司）；TDZ4低速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。對照品信息見表1 。

表1 對照品信息

甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；磷酸、磷酸二氫鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。所有中藥飲片均購自湖南省衡東縣中藥飲片廠，由湖南省婦幼保健院藥學(xué)制劑部潘濤副主任中藥師鑒定為正品。10批次中藥飲片批號見表2。

表2 10 批次中藥飲片批號

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACE EXCEL C18-AR色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈（B）：10 mmol/L磷酸二氫鈉水溶液（A），流速：1.0 mL/min，柱溫：35 ℃，檢測波長：215 nm，進樣量：10 μL。流動相梯度為：0～8 min：95%A；8～20 min：95～84%A；26～30 min：84%～70%A；30～45 min：70%A；45～50 min：70%～15%A；50～55 min：15%A；57～60 min：95%A。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制 分別取苦參堿、氧化苦參堿、咖啡酸、龍膽苦苷、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、表小檗堿、連翹苷、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、地膚子皂苷Ic和蛇床子素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含213.2、234.0、143.4、201.6、212.6、205.6、211.0、209.2、212.2、203.8、206.6、2 086.0、46.3 μg的溶液，即得。分別取適量苦參堿、氧化苦參堿、咖啡酸、龍膽苦苷、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、表小檗堿、連翹苷、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、地膚子皂苷Ic和蛇床子素于容量瓶中，用甲醇定容，過0.22 μm有機系濾膜，制得含有13種成分的混合對照品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備 按照處方量（共364 g）精密稱取藥材置不銹鋼鍋中，參考《湖南省醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》，加2 944 mL（8倍）水浸泡30 min，武火煮沸后轉(zhuǎn)為文火煎煮45 min，濾過得藥液；殘余藥渣再加2 184 mL（6倍）水煎煮45 min，使用布氏漏斗過濾，合并2次濾液，減壓濃縮（60 ℃），轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用純凈水定容至1 000 mL，得標(biāo)準(zhǔn)湯劑。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)湯劑1 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm有機系微孔濾膜濾過，得標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液。

2.2.3 單味藥材溶液的制備 按照處方量分別稱取陰炎凈洗液單味藥材，按“2.2.2”項下樣品制備方法制備各單味藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液10 μL，重復(fù)進樣測定6次，記錄色譜圖，選擇連翹酯苷A峰（30號峰）作為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間RSD均小于0.9%，相對峰面積RSD均小于1.6%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.2”項下同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h以“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，選擇連翹酯苷A峰（30號峰）作為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.5%，相對峰面積RSD均小于2.1%，表明標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗 按“2.2.2”項下方法制得標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液6份，以“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，選擇連翹酯苷A峰（30號峰）作為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.3%，相對峰面積RSD均小于2.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 參照峰的選擇 在標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液色譜峰中，連翹酯苷A峰（30號峰）峰面積最大，保留時間適中，分離度好，故選為參照峰。

2.4.2 指紋圖譜的建立 按“2.2.2”項下陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法制備10個不同批次的陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按照“2.1”項下方法進樣分析。應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”進行多點校正，然后匹配生成對照指紋圖譜（見圖1），確定有53個共有峰，10批陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對照指紋圖譜比較相似度均大于0.950（見表3），表明不同批次中藥飲片的化學(xué)成分及標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法比較穩(wěn)定。

圖1 10 批次陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑疊加指紋圖譜及對照指紋圖譜

表3 10 批次陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度數(shù)據(jù)

2.4.3 色譜峰歸屬分析 結(jié)合陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑和各單味藥材供試品溶液的色譜圖進行分析，發(fā)現(xiàn)4、5、10、11、14、28、29、30、35、36、45、46、47、48、49號峰來源于苦參；2、8、15、18、24、25、29、34、36、41、44、46、47、52 號峰來源于蒲公英；17、19、29、31、32、33、46、47號峰來源于龍膽；2、6、7、12、13、14、17、20、21、23、25、26、27、29、30、32、33、34、36、42、44、46、47、48號峰來源于黃柏；2、6、12、26、28、29、30、33、35、36、38、40、43、51、52號峰來源于連翹；3、4、9、16、17、22、23、27、28、30、33、35、38、39、41、42、44、47、51、52號峰來源于黃連；47、48、50號峰來源于地膚子；47、48、52、53號峰來源于蛇床子；1、9、14、15、16、17、20、32、33、34、37、47、49號峰來源于百部。其中2號峰為蒲公英、黃柏、連翹共有；4號峰為苦參、黃連共有；6號峰為黃柏、連翹共有；9號峰為黃連、百部共有；12號峰為黃柏、連翹共有；14號峰為苦參、黃柏、百部共有；16號峰為黃連、百部共有；17號峰為龍膽、黃柏、黃連、百部共有；20號峰為黃柏、百部共有；23號峰為黃連、黃柏共有；25號峰為蒲公英、黃柏共有；26號峰為黃柏、連翹共有；27號峰為黃柏、黃連共有；28號峰為苦參、連翹、黃連共有；29號峰為苦參、蒲公英、龍膽、黃柏、連翹共有；30號峰為苦參、黃柏、連翹、黃連共有；32號峰為龍膽、黃柏、百部；33號峰為龍膽、黃柏、連翹、黃連、百部共有；34號峰為蒲公英、黃柏、百部共有；35號峰為苦參、連翹、黃連共有；36號峰為苦參、蒲公英、黃柏、連翹共有；38號峰為連翹、黃連共有峰；41號峰為蒲公英、黃連共有；42號峰為黃柏、黃連共有；44號峰為蒲公英、黃柏、黃連共有；46號峰為苦參、蒲公英、龍膽、黃柏共有；47號峰為苦參、蒲公英、龍膽、黃柏、黃連、地膚子、蛇床子、百部共有；48號峰為苦參、黃柏、地膚子、蛇床子共有；49號峰為苦參、百部共有；51號峰為連翹、黃連共有；52號峰為蒲公英、連翹、黃連、蛇床子共有。通過與混合對照品溶液比對分析，可確定其中13種成分：5號峰為苦參堿、10號峰為氧化苦參堿、18號峰為咖啡酸、19號峰為龍膽苦苷、23號峰為黃柏堿、30號峰為連翹酯苷A、39號峰為表小檗堿、40號峰為連翹苷、41號峰為黃連堿、42號峰為巴馬汀、44號峰為小檗堿、50號峰為地膚子皂苷Ic、53號峰為蛇床子素。混合對照品溶液、陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑和單味藥材溶液色譜圖見圖2。

圖2 混合對照品溶液、陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑和單味藥材溶液色譜圖

3 討 論

本研究考察了Agilent C18、Thermo Hypersil GOLD C18和ACE EXCEL C18-AR 3種色譜柱對目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明，采用Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱時，目標(biāo)化合物的色譜峰數(shù)較少，峰形較差；采用Agilent C18色譜柱時，色譜峰數(shù)較多，但個別化合物色譜峰分離效果差，峰形差；采用ACE EXCEL C18-AR色譜柱時，色譜峰數(shù)目多，各目標(biāo)化合物的分離效果和峰形均較好，故本研究最終采用ACE EXCEL C18-AR色譜柱進行后續(xù)實驗。

此外，本研究還考察了不同流動相體系（乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-10 mmol/L磷酸二氫鈉水溶液）的洗脫能力，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.1%磷酸水溶液時，目標(biāo)化合物的色譜峰多、信號響應(yīng)較強，但峰形不好，個別化合物峰出現(xiàn)分裂；采用乙腈-10 mmol/L磷酸二氫鈉水溶液時，目標(biāo)化合物的色譜峰數(shù)多且分離效果好。

根據(jù)文獻資料[19-22]，苦參堿、氧化苦參堿、咖啡酸、龍膽苦苷、黃柏堿、連翹酯苷A、表小檗堿、連翹苷、黃連堿、巴馬汀、小檗堿、蛇床子素分別在220、220、327、277、220、330、345、220、238、345、265、322 nm處有最大吸收。文獻報道[23]地膚子皂苷Ic多采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，本研究采用紫外檢測器在低波長處（215 nm）對其進行檢測，可獲得良好的峰形和響應(yīng)。綜合比較上述9個波長，最終選擇可測定的色譜峰數(shù)多、分離度好及峰響應(yīng)值較大的215 nm作為檢測波長。

本研究依據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》和《湖南省醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》，考察了兩種不同的陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法，并分別計算出膏率。第一種制備方法平均出膏率為8.76%，第二種制備方法平均出膏率為11.02%，故本研究選擇第二種方法制備陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

本研究建立的陰炎凈洗液標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜分析方法穩(wěn)定、可靠，可用于陰炎凈洗液的質(zhì)量控制。