黃成日 (延邊大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，延吉 133000)

機體通過正確地調(diào)節(jié)活化免疫細胞的信號傳遞，抵抗入侵的病原微生物。其中獲得性免疫起主要作用，主體為T 淋巴細胞或B 淋巴細胞。細胞膜上的T 細胞受體集中在免疫突觸的中央，與抗原提呈細胞結合形成免疫突觸［1］。1972 年Nicolson 提出細胞膜液態(tài)鑲嵌模型，當時這一重大發(fā)現(xiàn)在學界引起了轟動。隨著對細胞膜研究的深入，近年，脂質(zhì)組學逐漸受到了關注。1997 年Simons 和Ikonen 提出了［由神經(jīng)鞘脂質(zhì)和膽固醇形成的區(qū)域叫脂質(zhì)筏，它在細胞黏附和運輸膜蛋白的過程中發(fā)揮重要作用］的筏模型［2］。2001 年，在西班牙召開的歐洲生物科學研討會上正式提出了“脂質(zhì)筏(Lipid Raft)”的概念。脂質(zhì)筏是細胞膜上的功能微區(qū)，可以在膜中側向流動、聚集，從而完成信號轉導、物質(zhì)轉運等功能。脂質(zhì)筏對維持T 細胞穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，認清T 細胞活化與脂質(zhì)筏的密切關系有著重要意義。研究表明，改變脂質(zhì)筏的完整性會影響T細胞的功能，引起各種疾病。神經(jīng)鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)是脂質(zhì)筏的主要構成成分，在細胞膜上跨膜信號轉導中發(fā)揮重要作用。本文主要對脂質(zhì)筏SM 在T 細胞活化中的作用進行綜述。

1 脂質(zhì)筏的結構

脂質(zhì)筏存在于細胞生物膜上的特殊微區(qū)(microdomain)，不被去垢劑溶解，又稱detergent resistant fractions(DRF)［3］。這些由磷脂質(zhì)、鞘磷脂和膽固醇組成的脂質(zhì)將細胞膜分為功能不同的區(qū)域，保持一種液態(tài)有序相，不溶于去垢劑。這個區(qū)有許多名稱:不溶于去垢劑的糖脂富含區(qū)(Detergent-insoluble glycolipid-rich domain，DIGs)，不溶于去垢劑的膜(Detergent resistant membrane，DRMs)，富含糖脂的膜(Glycolipid-rich membrane，GEMs)，Triton 不溶復合物(Triton insoluble complexes，TIC)［4］。脂質(zhì)筏富含膽固醇和鞘脂，包括鞘磷脂和鞘糖脂(glycolsphingolipids)，如神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、GM2、GM3 等。并有特定的蛋白質(zhì)，如GPI(糖基磷脂酰肌醇)錨定蛋白等信號轉導蛋白，TCR、BCR、生長因子等跨膜轉運蛋白和功能蛋白;以及一些標記蛋白caveolin、flotillin、stomatin 等。目前脂質(zhì)筏分為小窩、富含糖鞘脂膜區(qū)、富含多磷酸肌醇膜區(qū)三種類型，不同類型含有某些特有的蛋白質(zhì)，故將這些蛋白稱為標記蛋白，如caveolin 是caveolae 上的標記蛋白，flotillin、stomatin是富含PIP2 膜區(qū)的標記蛋白［5］。鞘糖脂中GM1 是神經(jīng)節(jié)苷脂的一種，相對分子量為11 500，因其能與霍亂毒素-B 亞基特異性的結合，常作為脂質(zhì)筏的標記分子。到目前為止對筏的鑒定是以筏中的GM1的霍亂毒素B 亞基(cholera toxin B subunit;CTx)為探針進行分析的。筏的功能解析是用甲基-β-環(huán)湖精(methyl-β-cyclodextrin;MβCD)來進行的［6］。但是，對脂質(zhì)筏的主要構成成分的SM 的解析報道甚少。

通常，因為磷脂質(zhì)具有氫受體(Hydrogen acceptor)，不具有供氫體(Hydrogen donor)，因而磷脂質(zhì)之間不易結合，含多加不飽和脂肪酸的部分不對稱，不易形成聯(lián)網(wǎng)狀態(tài)。但是，飽和脂肪酸的SM 具有與氫結合必需的氫受體和供氫體，因而脂質(zhì)雙層結構中容易形成聯(lián)網(wǎng)狀態(tài)。其脂質(zhì)分配是不均一的，維持著非對稱性。即具有頭部膽堿的SM 或磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)等的飽和磷脂質(zhì)存在于細胞膜雙重結構的外層(Exoplasmic leaflet);磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)或 磷 脂 酰 肌 醇(Phosphatidylinositol，PI)等的不飽和磷脂質(zhì)存在于內(nèi)層(Cytoplasmic leaflet)。膽固醇則填充脂質(zhì)雙層間隙之中［7］，通過?；?acyl)鏈結合于SM，填補SM 間隙。這就是筏的實體，SM 和膽固醇密集的區(qū)域［6，8］。到目前為止已知的Ras 還有很多的酪氨酸激酶、接頭蛋白等各種信號傳導物質(zhì)聚集在筏(表1)。TCR的信號傳導為由通過聚集在筏的Lck 或Fyn 等酪氨酸激酶或LAT(linker for activation of T cells)信號傳導來實現(xiàn)的。

前面已提到生物膜上存在由脂質(zhì)構成的不同的微結構域和神經(jīng)鞘脂質(zhì)密集的細胞膜外層區(qū)域在細胞黏著或活化時起運輸膜蛋白的作用?？梢娔ぶ|(zhì)不是生物膜靜止的構成成分，而是動態(tài)移動，將情報提供給各種各樣的功能分子的匯合或集聚部位，而轉導重要的信號。

2 脂質(zhì)筏的功能

脂質(zhì)筏是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)停留和活動的平臺。脂質(zhì)筏在整個信號轉導過程中起到一個平臺的作用。細胞受刺激時，筏中的SM 迅速相互聯(lián)結凝集成更大的微結構區(qū)，這些結構又可以迅速形成一個或多個平臺。這個過程可以理解成脂質(zhì)筏由小的、無活性的狀態(tài)轉化為大的、有活性的狀態(tài)，即平臺的形成。脂質(zhì)筏選擇性地聚集不同的蛋白質(zhì)于細胞膜的兩側，脂質(zhì)筏中的脂質(zhì)對其進行修飾使蛋白嵌入脂質(zhì)筏中。脂質(zhì)筏在膜中側向流動可使多種距離較遠的蛋白質(zhì)聚集在脂質(zhì)筏內(nèi)，便于信號轉導［9］。脂質(zhì)筏還參與信使的形成、跨膜轉運、突觸傳遞、細胞膜非對稱性的維持、抗腫瘤、抗感染、細胞的增殖與凋亡及胰島素調(diào)節(jié)等［10，11］。

表1 筏中局限或集聚的分子Tab.1 Localized molecules cluster in raft

3 T 細胞活化與脂質(zhì)筏

T 細胞活化需要兩個信號:第一信號的產(chǎn)生依賴于TCR 與抗原提呈細胞(APC)所提呈的抗原肽-主要組織相容性復合體(MHC)復合物特異性結合，第二信號則來自于共刺激信號。APC 將共刺激分子(B7-1、B7-2、VCAM、ICAM、LFA 等)抗原提呈給特異性T 細胞，兩種細胞表面黏附因子圍繞TCR/抗原肽-MHC 凝聚，形成一狹小空間，即免疫突觸。突觸中存在一個由TCR 為中心族聚集而成的中央超分子活化簇［12］。

1998 年，美國癌研究所Samelson 等［13］研究人員發(fā)現(xiàn)linker for activation of cell(LAT)，闡明LAT 是局限在筏的結合蛋白，首次論證TCR 信號與筏的關系。TCR 與抗原肽-MHC 復合物特異性結合時，引起TCR 交聯(lián)。TCR 交聯(lián)時，TCR 復合物中的CD3、CD4 等膜分子發(fā)生聚集，CD3ξ 鏈的 immunoreceptor tyrosine-based activation motif(ITAM)受到磷酸化，磷酸化ITAM 里結合Syk 酪氨酸激酶屬的ZAP-70 后，與Lck 協(xié)同作用下酪氨酸磷酸化LAT、SLP-76 等結合蛋白。進而，通過磷酸化LAT、SLP-76、PLC-γ、Grb2、PI-3kinase、Cbl、Vav、SKP-76等的信號因子聚集在筏里［13］(圖1)。LAT 以后的信號途徑是Grb2 或SOS→Ras，Gads，SLP-76;Vav→Rac/cdc42;Nck，Wasp→肌動蛋白聚合;PLC-γ，Gads，SLP-76 →流入到細胞內(nèi)。伴隨著T 細胞活化，以LAT 為首的重要的激酶或結合蛋白和TCR 自身集聚在筏。但是，LAT 一直局限于筏中而TCR 是未受到刺激時不存在于筏中。那么，什么時間段和以什么方式TCR 移動到筏，尚不清楚。最近還有一種報道稱，TCR 在筏中凝聚之前或微小群集形成時TCR活化信號傳遞到LAT，其機制尚不清楚。［12，14］

4 靶向神經(jīng)鞘磷脂的脂質(zhì)筏解析的新策略

越來越多的研究顯示，神經(jīng)酰胺作為細胞內(nèi)信號傳導的第二信使，在腫瘤細胞增殖、信號傳遞、蛋白質(zhì)相互作用、黏附和凋亡中發(fā)揮很重要的作用。SM/神經(jīng)酰胺循環(huán)如下:SMase(Sphingomyelinase)促進SM 水解神經(jīng)酰胺磷脂酰膽堿為神經(jīng)酰胺和磷脂酰膽堿。神經(jīng)酰胺酶(Ceramidase)分解神經(jīng)酰胺形成神經(jīng)鞘氨醇(Sphingosine)。神經(jīng)酰胺在SMS作用下可轉變?yōu)镾M。神經(jīng)酰胺重新合成開始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的絲氨酸軟脂酰轉移酶催化的絲氨酸和軟脂酰-CoA 凝集，隨后的一系列反應產(chǎn)生ER 細胞質(zhì)內(nèi)神經(jīng)酰胺。如此，存在于細胞膜脂質(zhì)雙重結構外葉的SM 和細胞質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)酰胺之間形成SM/神經(jīng)酰胺周期，日常維持平衡(見圖1)。這種SM-神經(jīng)酰胺途徑介導的信號傳導已被證實是廣泛存在的。

圖1 神經(jīng)鞘磷脂/神經(jīng)酰胺代謝示意圖Fig.1 Schematic diagram of sphingomyelin and ceramide metabolism

很多一流雜志上刊登了有關脂質(zhì)筏的論文。但是，到目前為止對筏的檢測是以筏中的GM1 的霍亂毒素B 亞單位為探針進行分析的。筏的功能解析是用MβCD 破壞筏的方法進行的。但是，對脂質(zhì)筏的主要構成成分的SM 的解析幾乎沒有報道。因為沒有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)鞘磷脂合成酶(Sphingomyelin synthesis;SMS)基因，所以SM 合成經(jīng)路或SM 可視化方法沒確立下來。我們研究小組克隆神經(jīng)鞘磷脂合成酶基因SMS1、SMS2 和SMS3，并發(fā)現(xiàn)SM 特異性結合的標志物lysenin。用lysenin 的敏感性來確定細胞膜的SM。

我們將SMS1 基因轉入到無SM 的細胞株［WR/Fas-SM(-)］使其成為存在SM 的細胞株［WR/Fas-SMS1］。兩者Fas 表達量及細胞膜膽固醇與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 的量同等，但用lysenin 鑒定時只有WR/Fas-SMS1 表達SM。利用兩者首次闡明在筏的集聚或凋亡中的SM 的重要性［15］。

5 SM 沉默的細胞株和敲除小鼠模型的制備及解析

SM 是脂質(zhì)筏的重要構成成分，分布于細胞膜脂質(zhì)雙層結構的外層，發(fā)揮維持脂質(zhì)雙層結構的對稱性的作用，作為脂質(zhì)筏的標志物與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 發(fā)揮同樣的重要作用。所以，我們將神經(jīng)鞘磷脂酶基因SMS1-siRNA 轉染于jurkat T 細胞，建立SM 沉默的細胞株，分析其TCR 信號及細胞活化可見沉默細胞的T 細胞功能顯著下降［16］。CD69 是早期的白血球活化抗原，反映細胞免疫功能的標志物。正常的T 細胞受TCR/CD3 或CD3/CD28 的刺激時，逐漸地表達于細胞表面，受刺激6 h 開始出現(xiàn)，48 h 達到高峰，其后逐漸減弱，最后消失。表達CD69 需要T 細胞的膜結構和轉導TCR/CD3 信息傳導通路，才能將CD69 蛋白質(zhì)運輸?shù)郊毎?。用Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)刺激時沉默細胞和對照組細胞表達同等量的CD69，但是用CD3交聯(lián)刺激時在沉默細胞中顯著的減少。結果顯示神經(jīng)鞘磷脂與TCR/CD3 誘導的CD69 表達密切相關［16］。

CD3/TCR 信號活化途徑有經(jīng)LAT 傳導途徑和經(jīng)PI3K 傳導途徑兩種。我們轉入Jurkat T 細胞SMS1 的si-RNA 建立SM knockdown 細胞株，用蛋白印跡分析CD3 交聯(lián)刺激時ZAP-70 和LAT 及PKCθ的磷酸化，沉默細胞中ZAP-70 和LAT 及PKCθ 的磷酸化比對照細胞明顯地降低。說明細胞膜SM 是筏的重要成分而且在TCR 介導的T 細胞活化過程中發(fā)揮重要作用［9］。制備SM 敲除老鼠，用伴刀豆蛋白誘導肝炎時SM 敲除老鼠CD4+T 細胞功能明顯下降［16］。脂質(zhì)筏鞘磷脂通過CXCL12/CXCR4 途徑減小相應的信號傳遞，調(diào)節(jié)細胞遷移［17］。

因此SM 與免疫擔當細胞活化或細胞死亡密切相關，臨床上與自身免疫性疾病、變態(tài)反應性疾病的免疫異常、細菌或病毒感染性疾病，臟器移植或腫瘤排斥密切相關［18，19］。

6 結語與展望

隨著對脂質(zhì)筏研究的深入，對細胞膜上的微區(qū)結構逐漸清晰，但是仍然存在很多問題需要解決:①脂質(zhì)筏作為一種膜上微結構是否存在于所有生物膜上?②通過脂質(zhì)筏的研究能否阻止病原體的入侵?③能否在脂質(zhì)筏的角度提高腫瘤細胞對腫瘤藥物的敏感性或直接殺死腫瘤細胞?④脂質(zhì)筏在參與信號轉導機制并不清楚。

近年，生物膜領域細胞膜脂質(zhì)雙層結構的細胞膜外層和內(nèi)層脂質(zhì)分布不均，確立了其非對稱性(asymmetry)正是細胞膜的重要概念。且對生物膜的功能和raft 特性進行比較廣泛的研究。但是，為了更加客觀、更加自然的狀態(tài)上觀察空間和時間上變化的細胞膜，期待開發(fā)相應的研究方法和工具。因為Raft 的解析也存在技術上有限，對生物化學和生物物理的解析結果的評價存在不同的看法。

今后我們將進一步對①生物膜領域細胞膜脂質(zhì)雙層結構的細胞膜外層和內(nèi)層脂質(zhì)分布不均一性，非對稱性破壞為誘因的免疫細胞功能異常;②SM/神經(jīng)酰胺平衡的破壞為誘因的細胞的生存和死亡的信號傳導;③SMS1 敲除老鼠的自身免疫性疾病、腫瘤或感染疾病的發(fā)生;④利用SM 的調(diào)節(jié)的方法對免疫抑制劑，抗癌藥物的開發(fā)進行解析。

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