陶社學 李金興 雷玉艷 林 爽 (新疆醫(yī)科大學研究生院，烏魯木齊 830011)

近年來，國內(nèi)外關于載脂蛋白E(APOE)啟動子區(qū)多態(tài)性與冠心病(Coronary heart disease，CHD)相關性研究日益增多，但在不同人種及種群研究中，結果不盡相同，考慮可能與不同人群中APOE 基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域點突變或多態(tài)性不同有關〔1，2〕。本研究從新疆漢族及新疆第二大少數(shù)民族哈薩克族出發(fā)，探討兩民族冠心病患者載脂蛋白E 基因啟動子區(qū)多態(tài)性在兩民族之間的分布是否存在差異。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取長期生活在新疆地區(qū)的具有一定民族代表性的哈、漢民族冠心病病人，根據(jù)冠脈造影結果及WHO 1979 年CHD 診斷標準確定冠心病組。其中符合冠心病診斷標準哈薩克族104 例，平均年齡64 歲，男性占59.26%，有冠心病、高血壓病家族史者占14.8%。漢族冠心病人97 例，平均年齡65 歲，男性占62%，有冠心病家族史者占9.6%;有高血壓家族史的占17.0%;其中冠心病合并高血壓的患者占57.5%，冠心病合并糖尿病患者占25.6%。本研究開始前，已告知患者并得到患者及其家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取ApoE 啟動子區(qū)基因型的測定 采集哈、漢兩民族冠心病病人空腹血液標本，ACD抗凝，蛋白酶K 消化后，酚-氯仿抽提提取DNA［3］;利用SNaPshot SNP 分型技術對所得201 個樣本進行3 個SNP 位點分型。具體實驗步驟:(1)電泳DNA 樣本對其進行質(zhì)量檢查以及濃度的估計;(2)PCR 反應，PCR 引物:rs405509F:GCACAGGAAAGGACAGGGTCAG;rs405509R:CAGTCACGAGGTGGGCTGTTCT;rs449647F:TCCCTCTTGCTGAGGCTGGAGT;rs4-49647R:GCCACGTGGGCGAATCACTTA;rs7259620F:GGAGCCAGGAATGAGT-CCCAGT;rs-7259620R:GCACGGGTATGTTTGGTGA-CAA;反應體系(20 μl)包含1 ×GC Buffer Ⅰ，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μl 樣本DNA 和2 μl 多重PCR 引物。再對PCR 產(chǎn)物進行純化。(3)SNaPshot 多重單堿基延伸反應延伸引物:rs405509SR:TTTTTTTTTTTTTTTAGGACACCTCGCCCAGTAAT;rs449647SR:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAATCAC-TTAAGGTCAGGAG;rs7259620S-R:TTTTTTTTCCGTGGTTCAGCAGCAAGA。延伸反應體系(10 μl)包括5 μl SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2 μl 純化后多重PCR產(chǎn)物，1 μl 延伸引物混合物，2 μl 超純水。(4)純化后得到的延伸產(chǎn)物在ABI3130XL 基因分析儀上進行測序。

1.3 統(tǒng)計學方法 根據(jù)測序結果確定每個標本的等位基因型或基因型頻率，應用SPSS17.0 軟件計算各等位基因和基因型頻率的分布，組間基因型頻率和等位基因頻率差異比較用χ2檢驗，以P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 APOE 啟動子區(qū)多態(tài)性分布 本研究中，APOE 啟動子區(qū)各位點基因型及等位基因頻率均符合遺傳學Hardy-Weinberg 定律(P ＞0.05)，顯示研究樣本為遺傳平衡群體。

2.1.1 APOE 啟動子區(qū)基因多態(tài)性的分布在哈、漢冠心病病人中差異性研究 APOE 啟動子區(qū)三個位點各基因型及等位基因在哈、漢冠心病病人中的分布情況見表1～3。結果提示新疆地區(qū)哈薩克族與漢族患者中載脂蛋白E 基因啟動子區(qū)rs449647(AT)位點基因型及等位基因在兩民族之間差別具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見表2。rs405509(G-T)位點及rs7259620(G-A)位點基因型及等位基因在兩民族之間差異均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見表1、3。

表1 rs405509(G-T)位點基因型和等位基因頻率分布Tab.1 Rs405509(G-T)genotype and allele's frequency distribution

表2 rs449647(A-T)位點基因型和等位基因頻率分布Tab.2 rs449647(A-T)genotype and allele's frequency distribution

表3 rs7259620(G-A)位點基因型和等位基因頻率分布Tab.3 rs7259620(G-A)genotype and allele's frequency distribution

3 討論

近年有證據(jù)表明，載脂蛋白E 啟動子區(qū)-219(G/T)、-427 C/T 和-491 A/T 位點多態(tài)性與心血管疾病的發(fā)生有關〔1，4-6〕。在這些區(qū)域可以在體內(nèi)通過各種等位形式調(diào)控APOE 基因的表達及組織特異性，從而可能影響心血管等疾病的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸。因此，APOE 基因也可能通過其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的堿基置換改變ApoE 蛋白的表達量，從而增加對心血管疾病嚴重程度的影響［5，6］。

本研究從漢族及新疆第二大少數(shù)民族哈薩克族出發(fā)，結果發(fā)現(xiàn)在兩民族冠心病病人之間APOE 啟動子區(qū)rs449647(A-T)位點基因型及等位基因之間差別有統(tǒng)計學意義，提示該位點可能在兩民族之間存在差異，這與李光榮等［7］關于載脂蛋白E 啟動子區(qū)SNP 的分布及頻率與種族和地域因素有關的研究結論相一致，哈薩克族以游牧民族為主，注重高鹽、高脂，導致飲食中高熱量飲食的攝入增加，使APOE 基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)生點突變或多態(tài)可能性增加，從而改變ApoE 蛋白的表達量，在一定程度上影響脂代謝，加速了動脈粥樣硬化病變的過程，導致CHD 的發(fā)生。其他兩個位點在兩民族之間差別均無統(tǒng)計學意義，究其原因而言一方面可能是久居新疆的漢族在飲食、環(huán)境等方面與當?shù)厣贁?shù)民族相似，造成二者之間無差異的可能，也可能與本研究所選樣本代表性欠佳及樣本量不夠大有關，還應進一步擴大樣本含量及提高樣本代表性，使本研究準確性達到更高的水平，進而可以從分子生物學水平進一步了解同一地區(qū)不同民族之間冠心病發(fā)病的危險因素以及積極因素，起到預防疾病的作用。

本研究僅僅從rs405509(G-T)、rs449647(AT)、rs7259620(G-A)位點出發(fā)，選擇范圍較為局限，不能排除ApoE 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可能有其他的SNP影響ApoE 基因的表達，在以后的研究中可繼續(xù)擴大研究區(qū)域，尋找其他可影響ApoE 基因表達的SNP。

［1］Banares VG，Ariel Bardach，Graciela Peterson，et al.APOE -249T allele may reduce the risk of atherosclerotic lesions among middleaged women［J］.Mol Cell Biochem，2012，362:123-131.

［2］Ozturk Z，Enkhmaa B，Shachter NS，et al.Integrated role of two apoliprotein E polymorphisms on apolipoprotein B levels and coronary artery disease in a biethnic population［J］.Metab Syndr Relat Disord，2010，8(6):531-538.

［3］嚴冰冰，虞 濤，方華紅，等.應用實時熒光PCR 分析apoE3、4等位基因［J］臨床檢驗雜志，2008，26(3):197-199.

［4］Lambert JC，Brousseau T，Myllykangas L，et al.Independent association of an APOE gene promoter polymorphismwith increased risk of myocardial infarction and decreased APOE plasma concentrations-the ECTIM study［J］.Hum Mol Genet，2000，9:57-61.

［5］Banres V，Wyszynski D，Schreier L，et al.APOE-219G/T polymorphism related to serum lipid levels in atherosclerotic patients from Argentina［J］.Invest Clin，2010，51(1):17-26.

［6］Shu Ye，Louise Dunleavey，Wendy Bannister，et al .Independent effects of the -219G ＞T and e2/e3/e4polymorphisms in the apolipoprotein E gene on coronary artery disease:The Southampton Atherosclerosis Study［J］.Eur J Human Genetics，2003，11:437-443.

［7］李光榮，趙明祥.載脂蛋白E 基因啟動子-307～-7 區(qū)單核苷酸論著多態(tài)性與散發(fā)阿爾茨海默病的相關研究［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2010，9(10):721-722.