楊宏志，丁 潔，李志江，佟萬(wàn)兵

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

豆醬是我國(guó)傳統(tǒng)豆類發(fā)酵食品之一，制曲時(shí)霉菌分泌的葡萄糖苷酶在發(fā)酵過(guò)程中降解大豆中異黃酮糖苷鍵，釋放和游離出異黃酮單體成分，如大豆苷元(daidzein，De)、染料木素(genistein，Ge)、黃豆苷元(glycitein，Gle)，其含量要比原料大豆高出許多倍[1-3]。大量的科學(xué)研究已經(jīng)證明，大豆異黃酮(如染料木素)具有抗腫瘤、防止骨質(zhì)疏松癥、緩解更年期綜合癥以及防治心血管疾病等多種功效[4]。雖然已有報(bào)道豆醬具有潛在的黃酮生理活性，但沒(méi)有提出具體的豆醬異黃酮，尤其對(duì)于苷元成分的提取與功能性驗(yàn)證研究較少[5-7]。

目前大豆異黃酮的提取方法主要有醇浸提法、水解法、微波提取技術(shù)、超臨界流體萃取技術(shù)、超聲波提取技術(shù)等。乙醇提取效果優(yōu)于甲醇[8]；水解法得到的大豆異黃酮苷元的穩(wěn)定性遭到質(zhì)疑[9]；微波提取[10]易使大豆異黃酮苷元受熱而損失；超臨界流體萃取法對(duì)設(shè)備的耐壓性能等要求較高；超聲波提取技術(shù)是利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)加強(qiáng)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，加速有效成分的浸出，可用于皂苷、生物堿、黃酮、多糖等絕大多數(shù)功能成分的提取，且具有省時(shí)、節(jié)能、避免常規(guī)提取法對(duì)熱敏性物質(zhì)的破壞、溶劑用量少、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)[11-14]。謝明杰等[15]利用超聲波提取脫脂豆粕中的大豆異黃酮，結(jié)果表明超聲波提取法工藝簡(jiǎn)單、提取快速、提取率高，是一種提取異黃酮的新的有效方法。

本實(shí)驗(yàn)以某企業(yè)成品豆醬為原料，采用超聲波提取成品豆醬中染料木素成分，在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對(duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期得出超聲波提取豆醬染料木素的最佳工藝條件，為豆醬的功能成分研究及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成品豆醬(蛋白質(zhì)13.6%、氨基酸態(tài)氮0.5%、脂肪6.8%、糖類12.9%、鹽7.2%)由黑龍江寶泉醬業(yè)有限公司提供，經(jīng)恒溫干燥箱于50℃烘至質(zhì)量恒定，粉碎后過(guò)篩60目，貯存。

染料木素(純度≥99%) 美國(guó)Sigma公司；甲醇(色譜純)、乙醇(分析純) 天津市康科德科技有限公司；水為純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2130電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；FW 100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；TG20臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰有限公司；鼓風(fēng)恒溫干燥箱 河南愛(ài)博特科技發(fā)展有限公司；R200真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、V-500真空泵 瑞士步琪有限公司；C-2250高效液相色譜系統(tǒng) 天津蘭博科技有限公司；超聲波藥品處理機(jī) 濟(jì)寧金百特工程機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將豆醬粉在78℃條件下加入正己烷，按料液比1：6(g/mL)進(jìn)行脫脂8h，得豆醬脫脂粉。準(zhǔn)確稱取豆醬脫脂粉10g于250mL磨口燒瓶中，加入一定量的乙醇溶劑提取后，在一定的時(shí)間、溫度、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、功率、頻率等條件下進(jìn)行超聲波提取實(shí)驗(yàn)，經(jīng)真空抽濾、離心取上清液過(guò)0.45μm濾膜，待測(cè)。

1.3.2 染料木素的測(cè)定

參照GB/T 23788—2009《保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法：高效液相色譜法》[16]。

1.3.3 超聲波提取染料木素的單因素試驗(yàn)

對(duì)超聲波提取染料木素過(guò)程中的幾個(gè)重要因素，即乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度和功率，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在每個(gè)單因素試驗(yàn)中，除了考察因素以外，其他因素均不變，通過(guò)對(duì)染料木素得率的分析，優(yōu)化考察因素的水平，每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，取平均值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003與Design-Expert 8.0.4軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.5 染料木素提取量的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜圖譜

圖 1 染料木素標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.1 Standard curve of genistein determined by high performance liquid chromatography

2.2 染料木素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品進(jìn)高效液相色譜對(duì)應(yīng)的峰面積對(duì)豆醬中染料木素含量(μg/g)的線性方程為y = 210.76x＋87.638；R2=0.9776。

2.3 單因素對(duì)染料木素提取量的影響

2.3.1 超聲波提取時(shí)間對(duì)染料木素提取量的影響

設(shè)計(jì)提取時(shí)間為20、40、60、80、100min，固定染料木素的提取溫度35℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、功率弱，進(jìn)行提取時(shí)間對(duì)染料木素提取量影響的單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖 2 提取時(shí)間對(duì)染料木素提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of genistein

由圖2可知，染料木素提取量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)先升后降，在80min時(shí)染料木素的提取量達(dá)到最高，由于超聲波在傳播過(guò)程中可以產(chǎn)生一種輻射壓強(qiáng)，給予介質(zhì)和懸浮體以不同的加速度，且介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度遠(yuǎn)大于懸浮體分子的運(yùn)動(dòng)速度，從而在兩者間產(chǎn)生摩擦，這種摩擦力可使生物分子解聚，使細(xì)胞壁上的有效成分更快地溶解于溶劑之中[17]。在60～80min之間上升緩慢，基本達(dá)到溶解平衡。但在80min后得率開(kāi)始下降，因?yàn)檫@種輻射壓強(qiáng)對(duì)提取物有破壞作用，可能導(dǎo)致染料木素的分解或轉(zhuǎn)化。

2.3.2 超聲波溫度對(duì)染料木素提取量的影響

設(shè)計(jì)提取溫度為35、40、45、50、55℃，固定染料木素提取時(shí)間40min、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、功率弱，進(jìn)行提取溫度對(duì)染料木素提取量影響的單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖 3 提取溫度對(duì)染料木素提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of genistein

由圖3可知，隨提取溫度的升高，染料木素的提取量逐漸上升后又緩慢下降，其中以50℃時(shí)的提取量最高。因?yàn)闇囟壬?，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，有利于黃酮類化合物(染料木素)的滲透和溶解。但溫度太高可能使染料木素發(fā)生氧化，導(dǎo)致雜質(zhì)溶出量增加，給后續(xù)處理帶來(lái)麻煩，并且造成溶劑損失。

2.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)染料木素提取量的影響

設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%，固定染料木素提取溫度35℃、提取時(shí)間40min、功率弱，進(jìn)行乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)染料木素提取量影響的單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖 4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)染料木素提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of genistein

由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，染料木素提取量先上升后下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)達(dá)到最高，之后又開(kāi)始下降。原因可能是染料木素易溶于高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中，但乙醇體積分?jǐn)?shù)太高又使得一些醇溶性雜質(zhì)、色素、強(qiáng)親脂性成分溶出量增加，雜質(zhì)與染料木素競(jìng)爭(zhēng)和乙醇-水分子溶液體系結(jié)合，導(dǎo)致提取量下降[11]。

2.3.4 功率對(duì)染料木素得率的影響結(jié)果

設(shè)計(jì)功率為強(qiáng)和弱兩個(gè)水平，固定染料木素提取溫度35℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間40min，進(jìn)行功率對(duì)染料木素提取量影響的單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，超聲波提取在較低的功率下，可以實(shí)現(xiàn)較好的提取效果。可能是高超聲波的功率導(dǎo)致染料木素分解或轉(zhuǎn)化，因此，選取弱功率為最佳提取功率，固定超聲波功率進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖 5 不同功率對(duì)染料木素提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of genistein

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化染料木素提取工藝

2.4.1 染料木素提取綜合試驗(yàn)方案和因素水平

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)對(duì)染料木素提取量影響顯著的因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表 1 染料木素響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of RSM for genistein extraction

2.4.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

表 2 染料木素提取響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Design and results of RSM for genistein extraction

2.4.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及數(shù)值分析

為了研究不同條件對(duì)染料木素提取的影響和確定最佳提取條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見(jiàn)表 3。17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為兩類：其一是析因點(diǎn)，自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12個(gè)析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。以染料木素提取量為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響可以用下列函數(shù)表示：

Y=87.90＋3.74A－2.19B＋0.80C＋2.58AB－2.35AC＋4.10BC－2.21A2－9.36B2－5.79C2

進(jìn)一步對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，其系數(shù)顯著性結(jié)果見(jiàn)表3。

表 3 回歸模型方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

從表3可以看出，此模型P＜0.05，響應(yīng)面回歸模型顯著。R2=0.9730，表明97%的數(shù)據(jù)可以用這個(gè)方程解釋。各因素影響染料木素提取量的主次順序?yàn)锳＞B＞C。失擬項(xiàng)各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析表明該模型失擬不顯著，因此該二次方程能夠較好地?cái)M合真實(shí)的響應(yīng)面。

2.4.4 因素間的交互影響結(jié)果

為進(jìn)一步考察3個(gè)因素兩兩之間的交互作用對(duì)染料木素得率的影響，對(duì)其響應(yīng)面曲線以及等高線圖進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。

由圖6a可知，固定提取溫度50℃，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，染料木素提取量先呈上升趨勢(shì)而后趨于平穩(wěn)并有小幅下降；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)染料木素提取量逐漸升高，當(dāng)提取時(shí)間為60min左右時(shí)達(dá)到最高，之后又有所下降。從等高線圖可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間兩個(gè)因素之間的交互作用顯著。

由圖6b可知，固定提取時(shí)間60min，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，染料木素得率先呈上升趨勢(shì)而后趨于平穩(wěn)且有小幅下降；隨著提取溫度的升高，染料木素提取量逐漸升高，當(dāng)提取溫度49℃左右時(shí)，染料木素提取量隨溫度的升高而提高，繼續(xù)升高溫度，染料木素的提取量明顯降低。從等高線圖可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度兩個(gè)因素之間的交互作用顯著。

圖 6 各因素交互作用對(duì)染料木素提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of operating parameters on the extraction rate of genistein

由圖6c可知，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)和提取溫度的升高，染料木素的提取量不斷增大，當(dāng)提取時(shí)間為59min左右、提取溫度為49℃左右時(shí)達(dá)到最高，之后又顯著下降。從等高線圖可以看出，提取時(shí)間和提取溫度兩個(gè)因素的交互作用極顯著。

2.5 優(yōu)化提取工藝參數(shù)的驗(yàn)證

利用 Design Expert 軟件預(yù)測(cè)染料木素提取量的最優(yōu)提取條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)78.97%、提取時(shí)間59.61min、提取溫度49.40℃，相應(yīng)提取液中染料木素的提取量為99.55μg/g。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在該條件下染料木素提取量達(dá)100.07μg/g，與模擬計(jì)算值基本接近，表明響應(yīng)面法可有效用于染料木素提取方法的優(yōu)化。

3 結(jié) 論

3.1 選取乙醇為萃取劑，萃取效果好，且價(jià)格低廉，毒性小。乙醇-超聲波法的得率稍高于乙醇單獨(dú)萃取法，然而達(dá)到相同的提取效果時(shí)，乙醇-超聲波法所需的時(shí)間卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于乙醇單獨(dú)萃取法。

3.2 應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化染料木素的提取工藝，結(jié)果顯示，以提取量為指標(biāo)的染料木素最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)78.97%、提取時(shí)間59.61min、提取溫度49.40℃、超聲波功率弱。染料木素提取量100.07μg/g。

3.3 高效液相色譜法檢測(cè)同一組分時(shí)，不同色譜條件下的色譜圖差別較大，但對(duì)定性定量的結(jié)果影響不大，檢測(cè)時(shí)只須保證被測(cè)組分及其標(biāo)準(zhǔn)品在相同的色譜條件下檢測(cè)即可。

3.4 超聲波提取法適用于豆醬中染料木素的提取，為豆醬中染料木素的進(jìn)一步純化及豆醬的豆醬的功能性開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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