鄭冰婷 董泓宏 張樹輝

溫州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)2010級 浙江溫州 325035

生長曲線是細菌在液體培養(yǎng)基中的生長規(guī)律的曲線，即將一定量的細菌接種到一定容積的液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進行培養(yǎng)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)進行作圖所得到的曲線［1-3］。典型生長曲線可分為遲緩期、指數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期，因此，本實驗所做12h內(nèi)的嗜熱鏈球菌的生長曲線僅包括其遲緩期和指數(shù)生長期。測定微生物生長曲線有多種方法，有血球計數(shù)板法、平板菌落計數(shù)法、稱重法和比濁法。本實驗結(jié)合涂布平板法和比濁法，先繪制吸光度與活菌數(shù)對數(shù)值的關(guān)系曲線，再結(jié)合該曲線所測各時間段的吸光度值對應(yīng)一個活菌數(shù)的對數(shù)值，繪制得該菌的生長曲線。

1 實驗

1.1 儀器與材料:①儀器:旋渦混合器XW-80A，電子天平BS-6WL型，722S可見分光光度計，振蕩培養(yǎng)箱HZQ-X100，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱DYX-DHX-400-BS-Ⅱ型，醫(yī)用型潔凈工作臺DL-CJ-2N，立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-50SⅡ型，電熱恒溫水溫箱CU600型，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱GZX-GF101-2-S-Ⅱ型，微量加樣槍。②材料:TTC顯色劑，TPY培養(yǎng)基，試驗菌株為嗜熱鏈球菌。

1.2 方法:①原理:常規(guī)測定菌體濃度的方法有多種，如離心法、稀釋平板計數(shù)、重量法、血球計數(shù)板計數(shù)法、電導(dǎo)率法等。對于培養(yǎng)液沒有固體顆粒和色素產(chǎn)生的體系，比濁法最為簡便、迅速。當(dāng)光線通過菌懸液時，菌體的散射和吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內(nèi)，菌體濃度與透光度成反比，與吸光度成正比。結(jié)合涂布平板法和比濁法，先繪制吸光度與活菌數(shù)對數(shù)值的關(guān)系曲線，再結(jié)合該曲線所測各時間段的吸光度值對應(yīng)一個活菌數(shù)的對數(shù)值，可以更快繪制出該菌的生長曲線。②吸光度與活菌數(shù)對數(shù)值關(guān)系曲線的繪制:用生理鹽水配制不同濃度的嗜熱鏈球菌菌懸液，分別測定其吸光度，本實驗波長采用600nm，將菌懸液做適當(dāng)倍比稀釋，取較小3個稀釋度分別涂布于2個TPY瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)48h后計數(shù)，以0D600值為橫坐標(biāo)，以活菌數(shù)對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制嗜熱鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)曲線。③吸光度與時間關(guān)系曲線的繪制:取0D600值為0.153的菌懸液，移取100μl菌懸液于100ml TPY液體培養(yǎng)基中，置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每一小時取出適量測量0D600值，持續(xù)12小時，以時間為橫坐標(biāo)，以0D600值為縱坐標(biāo)，繪制嗜熱鏈球菌吸光度與時間關(guān)系曲線。④生長曲線的繪制:將上述所測12小時的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到12小時的活菌數(shù)對數(shù)值，以時間為橫坐標(biāo)，以活菌數(shù)對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制嗜熱鏈球菌生長曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸光度與活菌數(shù)對數(shù)值關(guān)系曲線，見圖1。

可以看到，嗜熱鏈球菌活菌數(shù)對數(shù)值與吸光度呈線性關(guān)系，線性方程為:y=5.6071x2+4.7859，R2=0.9913，則相關(guān)系數(shù) R=0.9956，可信度較高。

2.2 吸光度與時間關(guān)系曲線的繪制，見圖2。

2.3 生長曲線的繪制，見圖3。

2.4 討論:根據(jù)本次實驗結(jié)果，嗜熱鏈球菌的生長曲線有明顯的遲緩期以及對數(shù)生長期。①遲緩期為0～8h。在此過程中，細菌的數(shù)量稍有波動，但是還是處于一個比較低的菌密度，沒有快速的數(shù)量增長現(xiàn)象。②把8～11h為對數(shù)生長期。嗜熱鏈球菌在一定的環(huán)境下經(jīng)過了短暫的適應(yīng)期，進如快速生長的時期，此時期營養(yǎng)充足，細菌以對數(shù)生長，生長速率遠遠大于死亡速率，嗜熱鏈球菌的數(shù)目大量增加。③由生長曲線可見嗜熱鏈球菌于8h時的生長速度最快，8h后減慢在于細菌數(shù)的增加使得產(chǎn)生生長競爭。④若于實驗中發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌生長速度過快，則有極大可能是被污染，在實驗過程中必須嚴格按照無菌操作，每個時間段取菌液所用移液管必須經(jīng)過高溫烤箱滅菌過的，而且每個時間段所用需更換。

圖1 吸光度與活菌數(shù)對數(shù)值關(guān)系曲線

圖2 吸光度與時間關(guān)系曲線的繪制

圖3 生長曲線的繪制

3 結(jié)論

本次實驗所用嗜熱鏈球菌的該菌株生長曲線如上所示，并在8h左右達到最大生長速度，因而用于其他實驗該時間段的嗜熱鏈球菌為最佳。

1 劉慶濤，李穎，楊正濤，等.金黃色葡萄球菌血清5型的培養(yǎng)條件及生長曲線的測定［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，5(19):5662-5663.

2 王升智，高波，周智慧，等.重組大腸桿菌DH5α生長曲線的測定［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，21(11):96-98.

3 彭乙華，蔡燕，唐中，等.鮑曼不動桿菌生長曲線測定［J］.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2010，4(8):1297-1301.