胡 靜，孟芮羽，張 盈，孫 琳，杜雙奎*

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

紅小豆（Vigna angularis）為豆科植物赤豆的種子，外被赤褐色或紅色外衣包裹，又名赤小豆、紅豆。因其富含淀粉，可為人類提供膳食能量，所以又稱之為“飯豆”。紅小豆，全國(guó)各地都有栽培，每年產(chǎn)量為20～40萬(wàn)t，主要分布于華北、東北地區(qū)，南方部分地區(qū)也有少量種植[1]。據(jù)報(bào)道，每100g紅小豆中除含有糖類58.5g、蛋白質(zhì)20.0g、脂肪0.5g、粗纖維4.9g以及微量元素外，還含有色素、三菇皂甙、植物甾醇等有效成分。國(guó)內(nèi)外研究表明，紅小豆具有補(bǔ)脾、補(bǔ)血、生津、益氣、益腎、補(bǔ)肝等保健功能，在糖尿病、腫瘤等疾病的預(yù)防和控制方面具有一定的作用[2-4]。紅小豆豆皮中含有的多酚類物質(zhì)具有抗氧化作用[2]。紅小豆除直接食用外，常加工成豆沙或豆餡[5]，近年來(lái)也相繼開發(fā)了紅豆奶、紅豆冰激淋、紅豆酸奶等相關(guān)產(chǎn)品[6-7]。韓濤等[8]對(duì)紅小豆種皮中紅色素的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，高群玉等[9-10]對(duì)紅小豆淀粉理化特性研究，何梅等[11]對(duì)紅小豆膳食纖維開展了研究，YOUSIF AM等[12]研究了貯藏對(duì)紅小豆蛋白質(zhì)和淀粉性質(zhì)的影響。由此可見，對(duì)紅小豆的加工利用、性質(zhì)研究越來(lái)越深入，但涉及發(fā)酵研究鮮見報(bào)道。紅小豆中含有豐富的淀粉，可經(jīng)糊化、液化、糖化處理后成為可發(fā)酵性糖，從而為發(fā)酵微生物所用。本研究以紅小豆為試驗(yàn)材料，對(duì)紅小豆粉液化、糖化工序進(jìn)行研究，探討液化、糖化條件，以期為紅小豆的深加工、紅小豆發(fā)酵食品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅小豆：購(gòu)于陜西楊陵大型超市，籽粒飽滿，色澤正常，符合NY/T 599-2002。

DNS試劑（稱取3.25g 3，5-二硝基水楊酸溶于少量蒸餾水中，移入500mL容量瓶，加2mol/L氫氧化鈉溶液162.5mL，再加入22.5g丙三醇，搖勻，定容至500mL，貯存于棕色瓶放置7d后備用）；α-淀粉酶（活力≥3700U/g）、糖化酶（活力≥100000 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；HCl溶液、NaOH溶液等。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1200分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；SHA-C恒溫振蕩器：常州國(guó)華電器有限公司；KDC-40低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡：株式會(huì)社日立制作所（HITACHI）；MSP-1S型離子濺射儀：日本真空裝置有限公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

紅小豆→粉碎→加水→糊化→液化→糖化

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）粉碎：將紅小豆放入粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)40目篩，收集紅小豆粉備用。

（2）加水：取紅小豆粉，按料水比1∶4（m∶v）加入蒸餾水，為紅小豆淀粉的糊化做準(zhǔn)備。

（3）糊化：將紅小豆粉-水混合物沸水浴30min，使紅小豆淀粉充分吸水膨脹，發(fā)生糊化，期間不斷攪拌，有利于充分糊化。

（4）液化：液化是將淀粉水解成為可溶性的低聚糖或糊精的過(guò)程，液化效果的好壞直接影響后續(xù)的糖化作用。α-淀粉酶可以隨機(jī)降解淀粉內(nèi)的α-1，4糖苷鍵，使淀粉水解。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入一定量的α-淀粉酶，控制試驗(yàn)溫度、pH值，酶解30min，碘液顯色為無(wú)色，表明液化完全。

（5）糖化：糖化是進(jìn)一步將液化水解的產(chǎn)物水解成為小分子的糖的過(guò)程。糖化酶能催化水解α-1，6糖苷鍵，使淀粉水解更加徹底。在液化體系中加入一定量的糖化酶，在一定溫度、pH值條件下，糖化20h，分析糖化效果。

1.3.3 液化工序單因素試驗(yàn)

以還原糖含量為試驗(yàn)指標(biāo)，以α-淀粉酶添加量（0.005%～0.065%）、溫度（40℃～80℃）、pH值（4～8）為試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，分別研究液化條件對(duì)液化規(guī)律的影響，確定α-淀粉酶的酶解條件。

1.3.4 糖化工序單因素試驗(yàn)

以還原糖含量為試驗(yàn)指標(biāo)，以糖化酶加量（0.1%～1.7%）、溫度（50℃～80℃）、pH值（3～7）為試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，分別研究糖化因素對(duì)糖化效果的影響，確定糖化酶的酶解條件。

1.3.5 還原糖測(cè)定

采用DNS法測(cè)定液化液、糖化液中的還原糖含量。取適量液化液、糖化液于離心管中，于3800r/min離心30min，取上清液采用DNS法測(cè)定還原糖含量。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)觀察

分別取少量紅小豆粉、糖化殘?jiān)潭ㄔ趻呙桦娮语@微鏡的樣品臺(tái)上，并進(jìn)行噴金處理。經(jīng)過(guò)短暫干燥后，用掃描電子顯微鏡觀察并拍攝具有代表性的微觀結(jié)構(gòu)，以觀察紅小豆的水解情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅小豆液化條件的確定

2.1.1 α-淀粉酶加量對(duì)紅小豆液化效果的影響

固定液化溫度為60℃，pH值為5，設(shè)置α-淀粉酶添加量分別為0.005%、0.02%、0.035%、0.05%、0.065%（以紅豆粉質(zhì)量計(jì)），液化30min，α-淀粉酶加量對(duì)紅小豆液化效果的影響見圖1。

圖1 α-淀粉酶添加量對(duì)紅小豆液化效果的影響Fig.1 Effects of α-amylase amount on liquefaction of adzuki bean

由圖1可以看出，隨著α-淀粉酶添加量的增加，還原糖含量呈增加趨勢(shì)。當(dāng)α-淀粉酶添加量大于0.035%，還原糖含量增加趨于平緩。這可能是由于α-淀粉酶添加量達(dá)到0.035%時(shí)，α-淀粉酶與底物結(jié)合基本完全，致使還原糖含量基本保持不變。因此確定液化α-淀粉酶添加量為0.035%。

2.1.2 液化溫度對(duì)紅小豆液化效果的影響

控制α-淀粉酶添加量為0.035%，pH值為5，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃液化30min，液化溫度對(duì)紅小豆液化效果的影響見圖2。

圖2 溫度對(duì)紅小豆液化效果的影響Fig.2 Effects of temperature on liquefaction of adzuki bean

由圖2可知，隨著液化溫度的升高，還原糖含量呈先逐漸增大后減小趨勢(shì)，溫度為60℃時(shí)，還原糖含量最大。這與所選用α-淀粉酶為中溫生物酶有關(guān)。當(dāng)溫度超過(guò)60℃，α-淀粉酶的活性有所減弱，液化效果下降，還原糖含量逐漸減小。所以60℃為適宜的液化溫度。

2.1.3 pH值對(duì)紅小豆液化效果的影響

固定α-淀粉酶添加量為0.035%，溫度為60℃，分別在pH值為4、5、6、7、8時(shí)液化30min，pH值對(duì)紅小豆液化效果的影響見圖3。

圖3 pH值對(duì)紅小豆液化效果的影響Fig.3 Effects of pH on liquefaction of adzuki bean

由圖3可以看出，隨著pH值的升高，還原糖含量有先增大后減小趨勢(shì)。當(dāng)pH值為5時(shí)，還原糖含量最高。這可能是由于隨著pH值的增加，接近了α-淀粉酶的最適pH值，α-淀粉酶的活力逐漸增強(qiáng)，還原糖含量逐漸增加。隨著pH值的繼續(xù)增大，α-淀粉酶的活力越來(lái)越弱，作用力下降，還原糖含量逐漸減小。確定選取液化最適pH值為5。

2.2 紅小豆糖化條件的確定

2.2.1 糖化酶添加量對(duì)紅小豆糖化效果的影響

待液化完全后，按紅豆粉質(zhì)量分別添加0.1%、0.5%、0.9%、1.3%、1.7%（以紅豆粉質(zhì)量計(jì)）糖化酶，在60℃、pH 5的條件下糖化20h，以還原糖含量為指標(biāo)，分析糖化酶添加量對(duì)紅豆糖化效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 糖化酶加量對(duì)紅小豆糖化效果的影響Fig.4 Effects of glucoamylase amount on saccharification of adzuki bean

由圖4可知，隨著糖化酶加量的增加，還原糖含量呈不斷增加趨勢(shì)。當(dāng)糖化酶添加量為0.9%時(shí)，還原糖含量最大。當(dāng)糖化酶添加量超過(guò)0.9%，還原糖含量增加趨于平緩，表明糖化酶與底物已達(dá)到了飽和作用。確定糖化時(shí)的適宜加酶量為0.9%。

2.2.2 糖化溫度對(duì)紅小豆糖化效果的影響

控制糖化酶加量為0.9%，pH值為5，糖化溫度分別設(shè)為50℃、60℃、70℃、80℃，糖化20h，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 糖化溫度對(duì)紅小豆糖化效果的影響Fig.5 Effects of temperature on saccharification of adzuki bean

由圖5可以看出，糖化溫度對(duì)還原糖含量有影響，隨著溫度的升高，還原糖含量有下降趨勢(shì)，60℃時(shí)還原糖含量最高，表明糖化酶作用效果充分；70℃、80℃時(shí)還原糖含量明顯下降，這可能與部分糖化酶失活有關(guān)。因此確定糖化時(shí)的最適溫度為60℃。

2.2.3 pH值對(duì)紅小豆糖化效果的影響

固定糖化酶加量為0.9%，溫度為60℃糖化20h，pH值對(duì)紅小豆糖化效果的影響見圖6。

圖6 pH對(duì)紅小豆糖化效果的影響Fig.6 Effects of pH on saccharification of adzuki bean

由圖6可知，隨著糖化體系pH值升高，還原糖含量呈先增大后減小趨勢(shì)。當(dāng)pH值為4時(shí)，還原糖含量最大，但與pH值為3時(shí)的還原糖含量差異不顯著，pH值為7時(shí)，還原糖含量最低。這與試驗(yàn)用糖化酶適宜作用pH值為3～5有關(guān)。選擇pH值為4為最佳條件。

2.3 微觀結(jié)構(gòu)分析

對(duì)紅小豆粉、糖化殘?jiān)M(jìn)行電鏡掃描觀察，結(jié)果見圖7。

由圖7可以看出，紅小豆粉中的粉狀顆粒呈分散狀態(tài)，淀粉顆粒比較完整，為圓形、腎形，由蛋白膜、纖維等包裹。糖化殘?jiān)械鞍啄ふ归_，體系成為絮狀的團(tuán)塊結(jié)構(gòu)，蛋白膜上有凹陷或空洞，這可能是淀粉顆粒原來(lái)所在位置，淀粉顆?；就耆?，表明淀粉顆?；舅馔耆?。

圖7 電鏡掃描圖片（400×）Fig.7 Scanning electron microscopy images

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)紅豆粉液化與糖化條件單因素試驗(yàn)分析，紅小豆粉液化時(shí)α-淀粉酶加量為0.035%，液化溫度為60℃，pH值為5，液化30min還原糖含量為35.63mg/mL。其液化液在0.9%糖化酶、60℃、pH值為4時(shí)糖化20h，還原糖含量達(dá)87.10mg/mL，還原糖含量顯著提高。對(duì)糖化殘?jiān)M(jìn)行電鏡掃描觀察，紅小豆淀粉已基本水解完全，為后續(xù)發(fā)酵的進(jìn)行奠定良好的基礎(chǔ)。

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