郭亦玲，王曉磊，李碧園，王凱迪，劉 敏，杜宗軍*

（山東大學(xué)（威海），山東 威海 264209）

黑色素（melanin）是一種廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中的非均質(zhì)的類多酚聚合體，具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)，可呈現(xiàn)紅色、褐色及黑色。微生物產(chǎn)生的黑色素主要分為壁（膜）結(jié)合黑色素和胞外黑色素。黑色素通常不溶于水、酸溶液和普通有機(jī)溶劑。研究表明，這種色素對(duì)于生物的生長(zhǎng)、發(fā)育并非必不可少，但是卻能提高生物的生存和競(jìng)爭(zhēng)能力，可以為生物體抵抗紫外線和電離輻射、抗氧化、結(jié)合金屬離子，減少其對(duì)生物體的傷害，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用潛力[1-2]。黑色素應(yīng)用廣泛，但是許多合成色素對(duì)人體有一定的危害性，有的甚至有致癌作用，于是天然色素因其使用安全性越來(lái)越收到青睞[3]。產(chǎn)黑色素細(xì)菌資源較豐富，便于操作，且細(xì)菌黑色素一般是由體內(nèi)的酪氨酸酶催化酪氨酸，然后再經(jīng)一系列氧化過程而形成，屬于氨基酸的衍生物，具有無(wú)毒、無(wú)害、產(chǎn)品穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，因此研究微生物產(chǎn)生黑色素具有很大的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越得到廣泛重視。本文對(duì)一株高產(chǎn)黑色素菌株DH166的分類以及產(chǎn)胞外黑色素特性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

細(xì)菌DH166由本實(shí)驗(yàn)室分離自東海大陸架中部海域，50m深水層處。

1.2 培養(yǎng)基

2216 海洋細(xì)菌培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸鐵0.01g，瓊脂15g，陳海水1000mL，pH 7.2～7.6。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨5g，陳海水1000mL，pH 7.4。

酪氨酸培養(yǎng)基：葡萄糖1g，蛋白胨5g，牛肉膏5g，CaCl20.1g，L-Tyr2g，陳海水1000mL，pH 7.0。

5#培養(yǎng)基[4]：葡萄糖1g，（NH4）2SO45g，L-Tyr2g，陳海水1000mL，pH 7.0。

1.3 菌種鑒定

1.3.1 革蘭氏染色及形態(tài)觀察

根據(jù)文獻(xiàn)所述方法[7]，對(duì)DH166進(jìn)行革蘭氏染色，鞭毛染色，芽孢染色和運(yùn)動(dòng)性觀察等。

1.3.2 生理生化鑒定

需鹽性試驗(yàn)、生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)、氧化發(fā)酵試驗(yàn)，過氧化氫酶、明膠酶、淀粉酶、檸檬酸鹽利用等實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)進(jìn)行[8-9]。

1.3.3 16 S rDNA序列測(cè)定和分析[6]

將細(xì)菌接種在平板上，28℃培養(yǎng)過夜。取單一菌落懸浮于50μL無(wú)菌蒸餾水中，于100℃水浴加熱5min，離心，取上清作為PCR模板DNA。

擴(kuò) 增 16SrDNA 基 因 的 正 向 引 物 為 27F：5’-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3’（對(duì)應(yīng)于E.coil16S rDNA基因的第8～27個(gè)堿基位置），反向引物1492R：5’-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3’（對(duì)應(yīng)于E.coli16S rDNA基因的第1492～1510個(gè)堿基位置）。在100μL的PCR反應(yīng)體系中含有：1×PCR緩沖液，1.5mmol/L MgC12，4×dNTP混合物各200μmol/L，引物各0.5μmol/L，Taq DNA聚合酶1μL（5U/μL），2μL DNA 原液。PCR反應(yīng)條件為96℃預(yù)變性6min；接94℃變性1min，50℃復(fù)性lmin，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃溫育6min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，直接交由上海生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行純化和序列測(cè)定。

將測(cè)定的基因序列輸入Genbank，獲得收錄號(hào)。并運(yùn)用Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的細(xì)菌16S rDNA基因序列進(jìn)行相似性比較分析。

1.4 黑色素的提取

黑色素的提取和初步純化參照文獻(xiàn)的方法[5]：將菌株接種于Tyr發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)72h，發(fā)酵液過濾離心后，用鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH值為2～3，靜置過夜，12000r/min離心，將沉淀100℃烘干，即得到黑色素粗品。

1.5 黑色素的吸收光譜

取發(fā)酵液30mL 5000r/min離心15min，沉淀中加入丙酮5mL，混勻后，冰浴條件下超聲裂解，補(bǔ)加丙酮15mL，5000r/min離心5min，上清液即為色素萃取液。以丙酮為空白組，使用8453E分光光度系統(tǒng)對(duì)色素萃取液進(jìn)行全波段掃描，得到該色素的吸收峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性

DH166在海水配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈黑色，表面光滑，直徑2mm～3mm，由于細(xì)菌向培養(yǎng)基中分泌色素，菌落周圍的培養(yǎng)基呈現(xiàn)黑色。在2216海洋細(xì)菌培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)，但不如在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛。在酪氨酸培養(yǎng)基中，可以觀察到細(xì)菌向周圍的培養(yǎng)基中分泌大量的黑色色素，培養(yǎng)基中添加酪氨酸對(duì)于色素的產(chǎn)量具有明顯的促進(jìn)作用（見圖1）。在5#培養(yǎng)基上生長(zhǎng)非常微弱，初步分析是由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分不夠豐富。

圖1 細(xì)菌DH166在酪氨酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of DH166 on tyrosine medium

2.2 形態(tài)觀察及生理生化鑒定

形態(tài)觀察及生理生化鑒定的結(jié)果（見附表）。DH166為革蘭氏陰性桿狀菌，極生鞭毛，有運(yùn)動(dòng)性，未觀察到芽孢產(chǎn)生。在對(duì)DH166進(jìn)行培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌DH166的生長(zhǎng)需要豐富的營(yíng)養(yǎng)條件。如果培養(yǎng)基中不添加蛋白胨和牛肉膏一類含各種有機(jī)物的營(yíng)養(yǎng)成分，菌株的生長(zhǎng)就非常微弱。①21℃培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)黑色素的效果也不是很好。25℃生長(zhǎng)快，產(chǎn)黑色素效果好，28℃生長(zhǎng)快，但是產(chǎn)黑色素效果似乎不如25℃條件下好。②DH166生長(zhǎng)要求條件比較高。在2216E培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)，但總起來(lái)講長(zhǎng)得不是多好。在添加牛肉膏的培養(yǎng)基比2216E培養(yǎng)基中，細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況更好。此外，細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)比液體培養(yǎng)基好。進(jìn)行了細(xì)菌DH166唯一碳源利用的實(shí)驗(yàn)，在僅有無(wú)機(jī)鹽構(gòu)成的培養(yǎng)基中，分別添加了葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖等多種糖類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不添加營(yíng)養(yǎng)豐富的有機(jī)物的情況下，DH166在這些培養(yǎng)基中都不能夠生長(zhǎng)。

附表 DH166的形態(tài)及生理生化特征Attached table Morphology,the physiological and biochemical characters of DH166

2.3 16S rDNA序列測(cè)定和分析

按上述方法進(jìn)行序列擴(kuò)增，擴(kuò)增所得序列送往上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，得到核苷酸序列。16S rDNA序列提交至Genebank，獲得收錄號(hào)：DQ493656。DH 166在前述各種培養(yǎng)基上均有生長(zhǎng)，菌落呈黑色，表面光滑。過氧化氫酶、明膠酶、卵磷脂酶、氧化酶、硝酸鹽還原陽(yáng)性，淀粉酶、檸檬酸利用、V.P反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)、H2S產(chǎn)生、葡萄糖產(chǎn)氣、精氨酸雙水解等陰性，O/F試驗(yàn)發(fā)酵產(chǎn)酸，綜合16S rDNA序列分析結(jié)果，可初步確定該菌屬于假交替單胞菌屬。

2.4 黑色素的提取鑒定與吸收光譜

DH166液體培養(yǎng)物136mL，按文獻(xiàn)方法得177mg黑色素粗提物，即130mg/100mL。

按上述方法獲得DH166的吸收光譜（見圖2），由圖2可知，其最大吸收峰位于波長(zhǎng)232nm處。此次分離出的DH 166產(chǎn)黑色素產(chǎn)量高，達(dá)130mg/100mL，即1.3g/L，并且大量向培養(yǎng)基內(nèi)分泌，經(jīng)酪氨酸誘導(dǎo)可顯著提高其胞外黑色素的產(chǎn)量，而文獻(xiàn)報(bào)道的最高產(chǎn)量為0.60g/L，且不具酪氨酸誘導(dǎo)的特點(diǎn)[4]。

圖2 DH166的吸收光譜Fig.2 DH166 absorption spectrum

3 結(jié)論

從東海大陸架中部海域50m深水層處分離獲得一株產(chǎn)黑色素的菌株DH166，通過菌體形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，初步鑒定DH 166菌種屬于假交替單胞菌屬。

海洋具有高壓、高鹽、低營(yíng)養(yǎng)、低溫、無(wú)光照等獨(dú)特的環(huán)境，這些特殊的環(huán)境使得海洋微生物的種類更加多樣，代謝途徑更加復(fù)雜，初級(jí)代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物種類也更為繁多、結(jié)構(gòu)更加新穎，可能產(chǎn)生完全不同于陸地微生物的新型生物活性物質(zhì)。目前有關(guān)海洋細(xì)菌生產(chǎn)黑色素的研究還很少，對(duì)于海洋細(xì)菌所產(chǎn)黑色素的性質(zhì)是否與陸地細(xì)菌所黑色素相一致、黑色素對(duì)海洋細(xì)菌本身的生態(tài)學(xué)意義以及該黑色素是否具有其它生物活性還有待于進(jìn)一步深入研究[13]。由于該菌種產(chǎn)黑色素快，產(chǎn)量高，約為1.3g/L，且大量向培養(yǎng)基內(nèi)分泌，易于分離，因此DH 166菌種有望成為一類新的黑色素生產(chǎn)菌種。

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