張賀迎，徐新霞，任 磊，武金霞*

（1.河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 生命科學(xué)院，河北 保定 071002）

醬油是中國傳統(tǒng)的釀造調(diào)味品，是釀造微生物多種酶系協(xié)同作用于物料的結(jié)果。釀造微生物在生長繁殖過程中會分泌蛋白酶、淀粉酶、果膠酶等多種酶系，這些酶的活力、含量及比例影響醬油的產(chǎn)量和質(zhì)量[1-2]。氨基酸態(tài)氮目前仍是衡量醬油釀造質(zhì)量和產(chǎn)量的重要指標，在研究和生產(chǎn)中，常以米曲霉蛋白酶活力高低衡量菌株性能和跟蹤醬油釀造過程[3-4]。但醬油是集色、香、味、體于一體的調(diào)味品，醬色是衡量醬油感官質(zhì)量的重要組成部分，其形成主要依賴于非酶促褐變反應(yīng)，即醬醪中的蛋白質(zhì)原料、淀粉質(zhì)原料及其分解產(chǎn)物氨基酸、單糖類等物質(zhì)在一定條件下發(fā)生美拉德化學(xué)反應(yīng)[5-7]。

淀粉酶是指能催化淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的所有酶的總稱，在醬油色、香、味、體的形成中起重要作用[8]。成曲中淀粉酶的組成及活力對醬油的品質(zhì)有重要的影響[9]。

米曲霉（Aspergillusoryzae）和黑曲霉（Aspergillusniger）是釀造醬油制曲的重要微生物，不同菌株具有自身的特性。本實驗室發(fā)明的激活釀造技術(shù)能提高醬油產(chǎn)量和質(zhì)量，縮短發(fā)酵周期[10-13]。研究誘導(dǎo)激活劑對菌株淀粉酶組分及活性的影響，為了解誘導(dǎo)激活劑對不同菌株的激活特異性及淀粉酶在醬油釀造中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）滬釀3.042、米曲霉3.362、米曲霉HL、米曲霉ZH、米曲霉3042KG；黑曲霉（Aspergillus niger）滬釀3350、黑曲霉3.324。

豆粕麩皮固體培養(yǎng)基；Tris，可溶性淀粉，SDS，TritonX-100，丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺等。

1.2 主要儀器和設(shè)備

BG-Power 600電泳儀（BAYGENE），電泳槽（北京六一儀器廠，24D），凝膠成像儀Bio-Best 300M（SIM INTERNATION），水浴鍋，SH-5磁力攪拌器（BeiDe）。

1.3 方法

1.3.1 醬油成曲浸提液的制備

[14]，制備成曲浸提液。

1.3.2 淀粉酶活力測定

參考文獻[15]，采用DNS顯色法測定淀粉酶活力，酶活力單位定義為：在pH5.6檸檬酸緩沖液，溫度為4.0℃的條件下，5min內(nèi)水解20mg淀粉產(chǎn)生1mg麥芽糖的酶量為一個酶活力單位，以U表示。

1.3.3 Starch-PAGE檢測浸提液淀粉酶組分數(shù)量及活性比例分析

參考文獻[14]作相應(yīng)的改進，使用凝膠成像分析軟件Quantity One_v4.4.0.36分析膠中各條帶組分的活性比例。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)激活劑對各菌株淀粉酶組分的影響

圖1 各菌株淀粉酶活性電泳圖譜Fig.1 Electropherogram of amylase activity of each strain

由圖1可知，（1）7個曲霉菌株成曲浸提液的淀粉酶組分數(shù)量不同，黑曲霉滬釀3350、黑曲霉3.324、米曲霉3.362和米曲霉HL均含有4個淀粉酶組分，而米曲霉3.042和米曲霉3042KG含有3個淀粉酶組分，米曲霉ZH含有2個淀粉酶組分。（2）對于每一個菌株而言，誘導(dǎo)激活劑沒有改變淀粉酶組分的數(shù)量，只提高了不同淀粉酶組分的活力，進而提高了總淀粉酶活力。（3）將含有4個組分的黑曲霉滬釀3350、黑曲霉3.324、米曲霉3.362和米曲霉HL的組分按遷移率由小到大編號為1、2、3和4，比較7個菌株淀粉酶組分的遷移率?？梢姡浊箿?.042和米曲霉3.042KG顯示3個淀粉酶組分，分別與組分2、3、4對應(yīng)，而米曲霉ZH顯示2個淀粉酶組分，分別與組分2、3對應(yīng)。此外，從淀粉酶條帶的透明度分析，組分2是7個菌株中活力最高的組分，在醬油釀造淀粉類物質(zhì)的降解中可能起主要作用。（4）誘導(dǎo)激活劑對7個菌株不同淀粉酶組分的誘導(dǎo)激活作用不同。對米曲霉滬釀3042的組分4、黑曲霉滬釀3.350的組分4、黑曲霉3.324的組分1、米曲霉HL的組分1和3、米曲霉ZH的組分3、米曲霉3.042KG的組分2和3均有較強的激活作用。

2.2 誘導(dǎo)激活劑對各菌株淀粉酶總活力的影響

由圖2可知，添加誘導(dǎo)激活劑以后，各菌株的總淀粉酶活力均有提高，但是由于不同菌株的不同淀粉酶組分對激活劑的敏感性不同（見圖1），導(dǎo)致不同菌株總淀粉酶活力的提高程度不同，7個菌株的淀粉酶活力提高分別為15.55%、9.64%、5.42%、14.55%、14.77%、11.14%、15.24%。

3 討論

米曲霉3.362、HL、ZH、3.042KG是在米曲霉滬釀3.042傳代過程中分離出的變異菌株，已經(jīng)應(yīng)用于醬油工業(yè)生產(chǎn)，經(jīng)過變異后的各菌株在淀粉酶組分構(gòu)成和活力分布上也發(fā)生了變化。黑曲霉3.350和3.324廣泛用于制醋工業(yè)，2菌株的淀粉酶活力高于米曲霉菌株（圖2），但對激活劑的敏感性較米曲霉菌株差。本研究通過活性PAGE直觀觀察到各菌株淀粉酶組分及活性差異，對進一步研究誘導(dǎo)激活劑對不同菌株在醬油生產(chǎn)的作用打下了基礎(chǔ)。

圖2 激活對各菌株淀粉酶活力的影響Fig.2 Effect of activation on amylase activity of each strain

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