王 杰，韓曉彤，董新榮，李 霞*

（湖南農(nóng)業(yè)大學 理學院，湖南 長沙 410128)

連翹[1]（Forsythia suspensa）是木犀科植物連翹屬落葉灌木，性寒、味苦，常以果實入藥，是中藥中最常見的藥材之一[2-4]，具有清熱解毒、消結散腫、抗菌及抑制真菌等功能[5]，常見的中成藥如雙黃連口服液、銀翹片等制劑均是以連翹果實作為主藥[6]。連翹苷和連翹酯苷是中藥連翹的主要生物活性組分[7-8]，也是國家藥典所規(guī)定的連翹質量控制指標性成分[9]（連翹苷含量不少于0.15%）。研究表明，連翹苷和連翹酯苷均具有較好的抗菌和抗病毒作用[10-12]。

研究顯示，連翹資源在我國非常豐富，且連翹屬植物葉子與果實的成分有較好的一致性，如連翹葉中連翹苷含量遠高于連翹果實，含量差別超過40倍[13]。對連翹葉及連翹果實的化學成分分析顯示，連翹苷、連翹脂素、齊墩果酸等生物活性成分在葉中含量均高于果實[14]，因此連翹葉具有十分廣泛的藥用價值。目前人們對于連翹的藥用價值主要集中在連翹果上，尚未見關于連翹葉的利用開發(fā)，因此對于其研究不僅有利于擴大藥源，而且有利于連翹資源的綜合開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：連翹葉原料購于山西省運城市百葉農(nóng)特產(chǎn)有限公司。

試劑：連翹苷標準品（中國食品藥品檢定研究院）；乙醇、甲醇均為分析純。

儀器：UV-2450型紫外分光光度計（日本島津），DKS24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 連翹葉中連翹苷的提取方法

稱取4.0g干燥的連翹葉粉末，用一定濃度乙醇溶液浸泡0.5h，在一定功率下微波提取一定時間，過濾收集濾液。

1.2.2 連翹苷的檢測方法

以連翹苷為標準品繪制標準曲線，采用分光光度法測定。測定標準曲線方程為：A=0.02671x+0.00802（R2=0.99561，n=5）。式中：A為波長229nm 處的吸光度值；x為連翹苷的含量（mg/L）。

1.2.3 單因素試驗

準確移取一定體積按1.2.1法提取的濾液，定容后紫外分光光度法檢測連翹苷含量。研究乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間、提取功率及提取次數(shù)6個因素對連翹苷得率的影響，確定各因素的最佳范圍，每個因素重復試驗3次，取其平均值。

1.2.4 響應面試驗

基于單因素試驗結果，采用5因素5水平的Box-Behnken Design（BBD）試驗設計[7]，以乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）、微波功率（E）的值為自變量，以連翹苷的得率為因變量，研究響應值以及最佳變量的組合[15]。試驗因素水平及編碼見表1。整個試驗設計在中心點共有27次試驗、3個重復，試驗分2d隨機完成。

表1 響應面試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken experimental design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對連翹苷得率的影響

圖1 乙醇體積分數(shù)對連翹苷得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration fraction on forsythin yield

在一定溫度、料液比和功率條件下微波提取連翹葉一定時間，考察乙醇濃度對連翹苷得率的影響。由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，連翹苷得率隨之增加。當乙醇濃度到達70%vol以后，連翹苷得率隨著濃度增加變化不明顯，因此單次提取試驗中乙醇濃度選擇為70%vol。

2.1.2 料液比對連翹苷得率的影響

在一定溫度、乙醇濃度和功率條件下微波提取連翹葉一定時間，考察料液比對連翹苷得率的影響。由圖2可知，隨著料液比的增加，連翹苷得率隨之增加。當料液比為1∶9時，連翹苷得率上升趨勢逐漸變緩，結合考慮實際生產(chǎn)的綜合成本及生產(chǎn)效率，所以單次提取試驗中料液比選1∶9。

圖2 料液比對連翹苷得率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on forsythin yield

2.1.3 提取溫度對連翹苷得率的影響

圖3 提取溫度對連翹苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on forsythin yield

在一定乙醇濃度、料液比和功率條件下微波提取連翹葉一定時間，考察溫度對連翹苷得率的影響。由圖3可知，開始時隨著溫度的增加，連翹苷得率隨之增加。當溫度到達80℃后，隨著溫度的增加連翹苷得率呈現(xiàn)出下降趨勢，這可能是由于高溫導致連翹苷不穩(wěn)定所致，所以單次提取試驗中溫度選80℃。

2.1.4 提取時間對連翹苷得率的影響

圖4 提取時間對連翹苷得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on forsythin yield

在一定溫度、乙醇濃度、料液比和功率條件下微波提取連翹葉，考察浸提時間對連翹苷得率的影響。由圖4可知，開始時隨著提取時間的增加，連翹苷得率隨之增加。當提取時間達到7min后，隨著提取時間的增加連翹苷得率呈現(xiàn)出下降趨勢，這可能是由于時間過長導致連翹苷不穩(wěn)定，所以單次提取試驗中時間選7min。

2.1.5 微波功率對連翹苷得率的影響

圖5 微波功率對連翹苷得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on forsythin yield

在一定溫度、乙醇濃度、料液比條件下微波提取連翹葉一定時間，考察微波功率對連翹苷得率的影響。由圖5可知，開始時隨著提取功率的增加，連翹苷得率顯著升高。當功率到達320W以后，連翹苷得率隨功率的增加明顯下降，這可能是因為功率過高造成連翹苷不穩(wěn)定所致，所以單次提取試驗中微波功率選擇320W。

2.1.6 提取次數(shù)對連翹苷得率的影響

表2 提取次數(shù)對連翹葉中連翹苷得率的影響Table 2 Effect of extraction times on forsythin yield of leaves of forsythia

在一定溫度、乙醇濃度、料液比和一定微波功率條件下提取連翹葉一定時間，考察提取次數(shù)對連翹苷得率的影響。由表2可知，連續(xù)提取4次以后，Abs的值接近于0，因此不再進行第5次提取。用上述方式提取2次時，連翹苷的累積提取率達到96.67%，此時隨著提取次數(shù)的增加，連翹苷提取率受到的影響不大，綜合考慮提取率及生產(chǎn)成本，提取次數(shù)為2次。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面分析方案及試驗結果

在單因素試驗的基礎上，依據(jù)BBD的中心組合試驗設計原理，確定了5因素5水平的響應面分析法，提取次數(shù)均為2次。連翹苷的提取結果見表3。

2.2.2 多元二次響應面回歸模型的建立與分析

利用Design-Expert軟件對上述回歸模型進行方差分析，由表4可知，回歸模型的失擬項為0.1021，沒有顯著性差異；p值為0.0021，表明模型處理間差異極顯著。其R2值為0.9670，表明此模型能解釋96.70%響應值變化，這表明該模型具有良好的相關性。回歸模型各項的方差分析還表明，各因素一次項是顯著的，交互項AC、AD、AE和DE，二次項C2、D2、E2都表現(xiàn)為極高的顯著性，說明該模型的擬合度好。

表3 響應面設計和連翹苷得率Table 3 Box-Behnken experimental design matrix and corresponding experimental results of forsythin yield

利用Design Expert軟件，對試驗設計各組合處理得到的連翹苷得率進行二次回歸分析，建立多元響應面回歸模型。

表4 響應值二次模型的方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed response surface quadratic model

圖6 乙醇濃度、料液比、溫度、時間、功率交互作用對連翹苷得率影響響應面Fig.6 Response surface plots showing the pair wise interactive effects between every two factors including ethanol concentration,material-to-liquid ratio,extraction temperature,extraction time and microwave power

由回歸方程經(jīng)處理得到的乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間和提取功率之間的交互作用對連翹苷得率影響的響應面及其等高線圖見圖6。其中提取時間和提取功率的交互作用對連翹苷得率的影響最為顯著，表現(xiàn)為響應面落差較大，乙醇濃度和提取溫度的交互作用次之。其余因素之間的交互作用也表現(xiàn)出較顯著的效果。通過對圖6的分析可以看出，在此5個因素中，料液比對連翹苷得率的影響最為顯著，其余依次為提取功率、乙醇濃度、提取溫度和提取時間。此外，各交互因素的最佳作用點基本都落在了試驗范圍之內，證明此響應面試驗設計較為合理。

2.2.3 模型的驗證試驗

通過連翹苷得率的二次多項數(shù)學模型解逆矩陣，得出從連翹葉中提取連翹苷的最佳工藝條件參數(shù)為乙醇濃度80%vol，料液比1∶8，提取溫度90℃，提取時間5min，提取功率400W，在此條件下，連翹苷最高得率預測值0.2904%。為驗證RSA法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進行連翹苷提取試驗，重復3次得到連翹苷得率的平均值為0.2864%，與理論預測值相差不大，因此，采用RSA法優(yōu)化得到的提取條件準確可靠，具有實用價值。

3 結論

應用響應面設計法優(yōu)化出最佳提取條件：乙醇濃度為80%vol，料液比為1∶8，提取溫度為90℃，提取時間為5min，提取功率為400W，在此條件下的連翹苷得率預測為0.2904%。結果表明，利用響應面法優(yōu)化出的提取工藝模型可以較好的反映出連翹中連翹苷的提取條件，可作為連翹苷的新工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供技術參考。

[1]孟祥樂，李俊平，李 丹，等.連翹的化學成分及其藥理活性研究進展[J].2010，21（43）：4117-4119.

[2]李 雙，王東強，李志軍.連翹主要有效成分的提取與藥理作用[J].2011（2）：46-48.

[3]歐陽輝，謝麗艷，黃小方.貫葉連翹的化學成分與藥理研究進展及前景展望[J].2010（7）：78-80.

[4]樸香淑，樸香蘭，洪承權.中藥連翹體外抗氧化作用的研究[J].2008，17（1）：77-80.

[5]肖會敏，王四旺，王劍波，等.連翹抗病毒的研究進展[J].2010，7（2）：9-10.

[6]薛愧玲，袁王俊.連翹葉的藥理研究綜述[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（5）：1149-1150.

[7]曹曉燕，王東浩，思培峰，等.連翹不同部位連翹苷含量的比較[J].2009，31（4）：642-644.

[8]龐維榮，趙 平，劉養(yǎng)清，等.不同生長期的連翹中連翹酯苷及蘆丁含量動態(tài)研究[J].2007，2（5）：277-279.

[9]國家藥典委員會.中國藥典，Ⅰ部[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005.

[10]牛新華，邱世翠，邸大琳，等.連翹體外抑菌作用的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2002，13（6）：342-343.

[11]胡克杰，徐凱建，王躍紅，等.連翹酯甙體外抗病毒作用的實驗研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2001，8（2）：89.

[12]王婭麗，楊建雄，柴渭莉.連翹葉中連翹苷類成分的提取工藝研究[J].西北藥學雜志，2006，21（1）：9-10.

[13]李發(fā)榮，段 飛，楊建雄.中藥連翹及連翹葉中連翹苷含量的比較研究[J].西北植物學報，2004，24（4）：725-727.

[14]幕運動.響應面方法及其在食品工業(yè)中的應用[J].鄭州工程學院學報，2001，22（3）：91-94.

[15]黃家衛(wèi)，盛振華，余陳歡，等.利用響應面分析法優(yōu)化金銀花中的綠原酸的超聲提取工藝[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2010，27（11）：995-998.