胡大強(qiáng)，傅若秋，盧來春，宋宏宇，徐 靖，向明鳳

(中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400042)

四物口服液是依據(jù)四物湯組方，采用現(xiàn)代制劑工藝生產(chǎn)的中成藥口服液。四物湯源自宋代《太平惠民和劑局方》，是補(bǔ)血養(yǎng)血、活血調(diào)經(jīng)之經(jīng)典方劑，由熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎4味中藥組方，當(dāng)歸、熟地黃為君藥，臨床用于治療盆腔炎、腎炎、肩周炎等[1]。本研究中采用熒光分光光度法評(píng)價(jià)四物口服液體外對(duì)羥基自由基的清除作用，觀察到四物口服液具有體外清除致炎分子自由基的作用[2]，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

ZF－I型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠);培養(yǎng)皿(外徑80 mm);BS124S型電子分析天平(Sartorious);F－2500型熒光分光光度計(jì)(Hitachi，Tokyo Japan)。苯甲酸(分析純，重慶川東化工有限公司，批號(hào)為20080812);30%過氧化氫(成都科龍化工試劑廠，批號(hào)為20110219);四物口服液(批號(hào)為100715)和純化水均由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品測(cè)定

取22mmol/L的過氧化氫溶液1.00mL，分別加入不同稀釋倍數(shù)的系列樣品溶液2.00 mL，置外徑80 mm培養(yǎng)皿中混勻，254 nm紫外光照射25min，分別加入0.80mol/L苯甲酸3.30mL混勻，室溫放置5min，在激發(fā)波長(zhǎng)304 nm、發(fā)射波長(zhǎng)401 nm條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度。

2.2 熒光檢測(cè)條件的確定及試驗(yàn)可行性分析

在外徑80 mm培養(yǎng)皿中加入22 mmol/L過氧化氫溶液1.00mL和純化水 2.00mL，在 254 nm 紫外光下照射 25min，加入 0.80mol/L苯甲酸 3.30mL，室溫放置 5min，即得試樣 1;在外徑80mm培養(yǎng)皿中加入純化水3.00mL，在254 nm紫外光下照射 25min，加入 0.80mol/L 苯甲酸 3.30mL，室溫放置 5min，即得試樣2;精密吸取四物口服液1.00mL置100 mL容量瓶中，加純化水至刻度定容，搖勻，精密吸取上述液2.00 mL置外徑80mm培養(yǎng)皿中，再加純化水1.00mL，搖勻，在254 nm紫外光下照射 25min，加入 0.80mol/L 苯甲酸 3.30mL，室溫放置 5min，即得試樣3。

固定測(cè)定熒光測(cè)定參數(shù)，分別對(duì)上述3種試樣進(jìn)行熒光掃描，得熒光圖譜，見圖1。試樣1的最大激發(fā)波長(zhǎng)為304 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為401 nm。在激發(fā)波長(zhǎng)304 nm和發(fā)射波長(zhǎng)401 nm處測(cè)定，試樣1有較高熒光強(qiáng)度，試樣2和試樣3則與基線接近。因此，選擇激發(fā)波長(zhǎng)304 nm和發(fā)射波長(zhǎng)401 nm作為熒光檢測(cè)波長(zhǎng)用于四物口服液對(duì)羥基自由基的清除作用評(píng)價(jià)。

圖1 熒光發(fā)射光譜圖

2.3 苯甲酸溶液濃度的選擇

吸取1.00mL過氧化氫溶液(20mmol/L)置5個(gè)外徑80mm培養(yǎng)皿中，254 nm紫外光下照射25min，分別加入3.30mL不同濃度苯甲酸溶液并搖勻，放置5min后，測(cè)定熒光強(qiáng)度，結(jié)果見表1，熒光強(qiáng)度隨苯甲酸濃度增加而增加，濃度超過0.80mmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。

表1 苯甲酸溶液濃度選擇

2.4 紫外光照射時(shí)間對(duì)羥基自由基產(chǎn)生的影響

吸取 3.30mL 苯甲酸溶液(0.80mmol/L)和 1.00mL 過氧化氫溶液(22mmol/L)置外徑80mm培養(yǎng)皿中，混勻，在254 nm紫外光下照射不同時(shí)間，測(cè)定熒光強(qiáng)度，結(jié)果見表2。由表2可知，照射25min后溶液熒光強(qiáng)度最大，再增加紫外光照射時(shí)間熒光強(qiáng)度無顯著變化。因此，選定紫外光照射時(shí)間為25min。

表2 紫外光照射時(shí)間對(duì)羥基自由基產(chǎn)生的影響

2.5 過氧化氫線性范圍的確定

吸取1.00 mL不同濃度過氧化氫溶液于5個(gè)外徑80 mm培養(yǎng)皿中，置254 nm紫外光下照射25 min，分別加入3.30 mL苯甲酸溶液(0.80 mmol/L)，室溫放置5 min，測(cè)定熒光強(qiáng)度，結(jié)果見表3。

表3 過氧化氫濃度的選擇

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果

按2.1項(xiàng)測(cè)定四物口服液清除羥基自由基的 IC50(熒光強(qiáng)度降低50%時(shí)藥物濃度)為0.009 3倍原藥，結(jié)果見表4。

表4 四物口服液清除羥基自由基的能力

3 討論

基于不同濃度的四物口服液對(duì)羥基自由基的清除能力不同和苯甲酸的熒光強(qiáng)度極低，在測(cè)定四物口服液對(duì)羥基自由基清除率時(shí)，需向體系中加入不同稀釋倍數(shù)藥物，反應(yīng)后溶液中剩余的羥基自由基量不等，向溶液中加入過量苯甲酸，保證溶液中羥基自由基與苯甲酸反應(yīng)完全，檢測(cè)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度才能準(zhǔn)確反映四物口服液清除羥基自由基的能力。

試驗(yàn)觀察到 2.00 mL 20 mmol/L過氧化氫檢測(cè)體系，0.01～0.80mmol/L苯甲酸 3.30mL條件下，反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度隨苯甲酸濃度增加而增加，當(dāng)濃度超過0.80mmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度不再變化。因?yàn)樵诔^3.30mL(0.80mmol/L)苯甲酸時(shí)，體系中羥基自由基的量已相對(duì)不足，苯甲酸不能都轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)熒光物質(zhì)。

[1]李 瓊，李 萍，黃曉君.桃紅四物湯加減綜合治療實(shí)性痛經(jīng)療效觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志，2007，34(5):617 －618.

[2]趙淑杰，韓忠明，李彥穎，等.鹿藥提取物清除羥基自由基的研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31(2):59－62.