王 艷 Amit K Mitra Jatinder K Lamba 姬懷雪

1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇徐州 221006；2.美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)藥學(xué)院，美國(guó)明尼蘇達(dá) 55108

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一組高度異質(zhì)性的惡性血液腫瘤。阿糖胞苷是治療AML最重要的一線化療藥物，能提高患者生存率[1-2]。然而，阿糖胞苷耐藥的產(chǎn)生一直是影響AML患者生存率的瓶頸[2]。因此，鑒定影響阿糖胞苷耐藥性的關(guān)鍵基因的變異，對(duì)于避免阿糖胞苷耐藥性的發(fā)生有重要作用。異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase1，IDH1）是近期發(fā)現(xiàn)的一種NADP依賴型的異檸檬酸脫氫酶[3]。研究發(fā)現(xiàn)，IDH1基因突變致與急性白血病的發(fā)生與不良預(yù)后密切相關(guān)[4]。然而，IDH1對(duì)非洲人群急性白血病患者阿糖胞苷耐藥性的影響目前并不清楚。本研究旨在探討IDH1對(duì)非洲人群AML患者阿糖胞苷耐藥性的影響，為提高該人群AML患者阿糖胞苷的療效，降低不良反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

應(yīng)用來自國(guó)際人類基因組計(jì)劃60個(gè)非洲人（YRI）EBV病毒轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞系（lymphoblastoid cell line，LCL）。上述細(xì)胞株購自美國(guó)Coriell醫(yī)學(xué)研究所。將上述細(xì)胞株置于含有L-谷氨酰胺（Lonza Walkersville，Inc.，Walkersville，MD）的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中，加15%熱滅活血清37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)[5]。

1.2 阿糖胞苷的細(xì)胞耐藥性檢測(cè)

阿糖胞苷耐藥性檢測(cè)參照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行。予不同濃度的阿糖胞苷（1，5，40，80 μmol/L）加入細(xì)胞中共培養(yǎng)72 h后，應(yīng)用alamar Blue試劑盒（Biosource international，Camarillo，CA）參照制造商說明書檢測(cè)細(xì)胞存活曲線、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。梯形法計(jì)算阿糖胞苷曲線下面積（AUC）判斷該藥的耐藥性（以更高的AUC表示），AUC進(jìn)行Log2轉(zhuǎn)換后統(tǒng)計(jì)分析[6]。

1.3 IDH1基因多態(tài)性檢測(cè)

DNA樣本來自HapMap非洲人群的LCL細(xì)胞株。參照文獻(xiàn)[7]，針對(duì)IDH1突變熱點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)引物，由明尼蘇達(dá)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)基因組學(xué)中心合成。引物序列如下：

正向：5'CTCAGAGCCTTCGCTTTCTG3'；

反向：5'TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT3'。 Taqman PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性7 min；然后95℃變性30 s，60℃退火 35 s，72℃延伸 40 s，35 個(gè)循環(huán)后，70℃延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)目的條帶樣本由明尼蘇達(dá)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)基因組學(xué)中心直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）中序列比對(duì)（BLAST）比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件R軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)。連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）與單倍型分析、單倍型人群頻率估算采用Haploview 4.2分析。IDH1 SNPs的基因型、最小等位等位基因與阿糖胞苷AUC的分析采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)及Wilcox檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)，非洲人群樣本中，IDH1 rs10173938、rs10192397與阿糖胞苷更高的AUC相關(guān)（提示耐藥）。其中，IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于rs10173938的AC及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [rs10173938：AA 比（AC+CC），P=0.040]。IDH1 rs10192397純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于與CT及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（rs10192397：（CC+CT）比 TT，P=0.036]。 見表 1。

3 討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)，IDH1 的 SNPs（rs10173938、rs10192397）變異與非洲人群AML患者的阿糖胞苷耐藥性有關(guān)。IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于rs10173938的AC及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC（P<0.05）。提示，IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者對(duì)阿糖胞苷耐藥可能性大，IDH1 rs10173938的最小等位基因A可能是該部分人群對(duì)阿糖胞苷耐藥的風(fēng)險(xiǎn)因子。IDH1 rs10192397純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于與CT及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC（P<0.05）。提示，純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷耐藥可能性大，IDH1 rs10192397的最小等位基因T可能是該部分人群對(duì)阿糖胞苷耐藥的風(fēng)險(xiǎn)因子。具體的功能及意義在進(jìn)一步研究中。

表1 非洲人群IDH1單核苷酸多態(tài)性對(duì)阿糖胞苷AUC的影響（±s，n=60）

表1 非洲人群IDH1單核苷酸多態(tài)性對(duì)阿糖胞苷AUC的影響（±s，n=60）

注：P1為 AA 比（AC+CC）；P2為（CC+CT）比 TT

rs10173938 rs10192397內(nèi)顯子內(nèi)顯子AA（n=16）AC（n=32）CC（n=9）CC（n=13）CT（n=34）TT（n=13）3295.371±658.214 2833.301±497.002 3195.382±776.748 2857.324±540.578 2780.298±630.892 3285.368±585.815 P1=0.040 P2=0.036 rs編號(hào) 定位 基因型 阿糖胞苷曲線下面積 P值

IDH1基因突變是急性白血病的發(fā)生及不良預(yù)后的重要因素。IDH1密碼子132R的突變能誘發(fā)細(xì)胞因子自主性，阻礙造血干細(xì)胞分化，誘導(dǎo)AML發(fā)生[7-8]。近期文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，攜帶有IDH1密碼子132R和IDH2密碼子R172突變基因的正常核型急性髓細(xì)胞白血?。–N-AML）患者或同時(shí)伴有IDH及NPM1變異的老年CN-AML患者應(yīng)用阿糖胞苷化療后易發(fā)生阿糖胞苷耐藥，完全緩解率降低[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，IDH1的SNPs（rs10173938、rs10192397）與非洲人群樣本中阿糖胞苷的耐藥性有關(guān)。進(jìn)一步證明，IDH1基因突變是導(dǎo)致AML患者不同的預(yù)后及阿糖胞苷耐藥發(fā)生的重要因素。具體功能及機(jī)制需要大樣本研究進(jìn)行證實(shí)。

[1]Lamba JK，Crews KR，Pounds SB，et al.Identification of predictive markers of cytarabine response in AML by integrative analysisofgene-expressionprofiles with multiple phenotypes[J].Pharmacogenomics，2011，12（3）：327-339.

[2]Cros E，Jordheim L，Dumontet C，et al.Problems related to resistance to cytarabine in acute myeloid leukemia [J].Leuk Lymphoma，2004，45（6）：1123-1132.

[3]Parsons DW，Jones S，Zhang X，et al.An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme[J].Science，2008，321（5897）：1807-1812.

[4]Paschka P，Schlenk RF，Gaidzik VI，et al.IDH1 and IDH2 mutations are frequent genetic alterations in acute myeloid leukemia and confer adverse prognosis in cytogenetically normal acute myeloid leukemia with NPM1 mutation without FLT3 internal tandem duplication[J].J Clin Oncol，2010，28（22）：3636-3643.

[5]Mitra AK，Crews KR，Pounds S，et al.Genetic variants in cytosolic 5'-nucleotidaseⅡare associated with its expression and cytarabine sensitivity in HapMap cell lines and in pa tients with acute myeloid leukemia[J].J Pharmacol Exp Ther，2011，339（1）：19-23.

[6]Hartford CM，Duan S，Delaney SM，et al.Population-specific genetic variants important in susceptibility to cytarabine arabinoside cytotoxicity[J].Blood，2009，113（10）：2145-2153.

[7]Green A，Beer P.Somatic mutations of IDH1 and IDH2 in the leukemic transformation of myeloproliferative neoplasms[J].N Engl J Med，2010，362（4）：369-370.

[8]Ward PS，Patel J，Wise DR，et al.The common feature of leukemia-associated IDH1 and IDH2 mutations is a neomorphic enzyme activity converting a-Ketoglutarate to 2-Hydroxyglutarate[J].Cancer Cell，2010，17（3）：225-234.

[9]Becker H，Marcucci G，Maharry K，et al.Favorable prognostic impact of NPM1 mutations in older patients with cytogenetically normal de novo acute myeloid leukemia and associated gene-and microRNA-expression signatures：a Cancer and Leukemia Group B study[J].J Clin Oncol，2010，28（4）：596-604.

[10]Nicolas B，Olivier N，Aline R，et al.Prognostic Impact of Isocitrate Dehydrogenase Enzyme Isoforms 1 and 2 Mutations in Acute Myeloid Leukemia：A Study by the Acute Leukemia French Association Group[J].J Clin Oncol，2010，28（23）：3717-3723.