柯昌松，王轟，牟偉麗

（蓬萊京魯漁業(yè)有限公司，山東 蓬萊 265609）

槲皮素是番石榴葉提取物，屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌等廣泛的生理活性，番石榴葉提取物-槲皮素通過(guò)拮抗鈣離子通道，使病毒因缺少鈣離子的輔助而不能進(jìn)入細(xì)胞，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力，達(dá)到抗病毒的目的[1-3]?，F(xiàn)在，食品腐敗是食品界非常關(guān)注的問(wèn)題。微生物的侵襲是食品腐敗的主要因素之一，我國(guó)每年由于微生物侵襲損失大量糧食。因而在生產(chǎn)加工和儲(chǔ)藏的過(guò)程中，防腐劑的使用就顯得尤為重要。但是由于合成的食品添加劑往往有一定的毒副作用，現(xiàn)在人們?cè)絹?lái)越傾向于選擇天然物質(zhì)作為食品防腐劑，因而高效的天然食品防腐劑成為食品工業(yè)的研究熱點(diǎn)。黃酮類化合物如槲皮素具有抗菌、抗炎、抗氧化特性，在濃度為2.5%時(shí)可抑制葡萄球菌和枯草桿菌的生長(zhǎng)，可用作食品防腐保鮮劑[4]。根據(jù)黃酮類物質(zhì)具有較強(qiáng)抑菌活性的特點(diǎn)，本試驗(yàn)以滅菌生理鹽水為對(duì)照，研究了番石榴葉提取物-槲皮素黃酮類物質(zhì)對(duì)常見(jiàn)致病細(xì)菌的抑制作用，通過(guò)濾紙圓片法測(cè)抑菌圈的定性實(shí)驗(yàn)和不同濃度番石榴葉提取物液測(cè)最低抑菌濃度，初步了解番石榴葉提取物-槲皮素的抑菌情況，為進(jìn)一步探尋其作為“綠色”防腐劑的提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 培養(yǎng)基及試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、肉湯培養(yǎng)基、滅菌生理鹽水（0.85%）。

1.1.2 菌種

1.1.3 儀器

滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、酒精燈、鑷子、接種環(huán)、移液槍、打孔機(jī)、濾紙片（注：濾紙圓片直徑為2 mm，厚度為1.5 mm 的新華濾紙）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 番石榴葉提取物-槲皮素的制備

將番石榴葉鮮葉洗凈、曬干，放入烘箱烘烤后粉碎，用石油醚浸泡脫脂3 次，每次24 h，脫脂后的葉子加水約20 倍，煮沸提取二次，在攪拌下緩慢加入石灰水至pH 為8～9，然后加入3%的硼酸，在此pH 條件下煮20 min～30 min；趁熱過(guò)濾，殘?jiān)磸?fù)過(guò)濾3 次，在60 ℃～70 ℃條件下，用濃鹽酸將pH 調(diào)為5，酸水液放置24 h，抽濾；用水將沉淀物洗至中性，70 ℃～80 ℃干燥后，然后95%乙醇重結(jié)晶，用甲醇做洗脫劑，將提取物的溶液烘干制成干粉，得到槲皮素黃綠色純品（＞90 %）。實(shí)驗(yàn)時(shí)以50%乙醇稀釋成不同的濃度。將提取物稱取1.000 0 g 加入10 mL 50%乙醇溶液加塞置4 ℃冰箱浸泡過(guò)夜，取出再置80 ℃水浴熱浸4 h，縮成1 g/mL的番石榴葉提取物，置冰箱備用。

1.2.2 菌株的制備

將菌種移接入相對(duì)應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上，重復(fù)接種，記錄接種名稱和日期。細(xì)菌置35 ℃～37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h～24 h，每種菌株取2 支供測(cè)試用，其余注明日期。置于0 ℃～4 ℃，冷藏備用。

1.2.3 番石榴葉提取物儲(chǔ)存液制備

番石榴葉提取物儲(chǔ)存液制備，見(jiàn)表1。

以AES算法為例，在設(shè)計(jì)加解密算法硬件模塊時(shí)以分組算法為基礎(chǔ)。將明文按一定長(zhǎng)度分組，明文組經(jīng)過(guò)加密運(yùn)算得到密文組，密文組經(jīng)過(guò)解密運(yùn)算（加密運(yùn)算的逆運(yùn)算）還原成明文組。分組算法分組可使用128、192或256位甚至更高位的密鑰，可對(duì)應(yīng)10、12等輪數(shù)[13]。分組算法的示意圖如圖9所示。

表1 番石榴葉提取物的稱量Table 1 The weight of Guava leaf extract

1.2.4 培養(yǎng)基的制備和制備平板

將配置好的培養(yǎng)基，經(jīng)高壓滅菌后，冷卻至45 ℃，傾注于干熱滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15 mg～20 mg。先加1 mL 菌液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，讓菌液與營(yíng)養(yǎng)瓊脂充分搖勻，記錄菌株名稱、濃度和日期。

1.2.5 抑菌圈的測(cè)定（濾紙圓片法）[5]

番石榴葉提取物進(jìn)行濾紙圓片實(shí)驗(yàn)前，先做定性實(shí)驗(yàn)，取經(jīng)高壓滅菌后置55 ℃～60 ℃烘箱內(nèi)烘2 h 的濾紙片，分別置于濃度為1 g/mL 槲皮素水溶液中浸泡10 min，用鑷子鑷取濾紙圓片，在瓶壁上瀝去多余的溶液，放入菌液平板上。記錄下菌編號(hào)、藥片的濃度編號(hào)和日期，細(xì)菌平板倒置35 ℃～37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察有無(wú)抑菌作用。

將番石榴葉提取液（相當(dāng)原液1 g/mL 的量）逐步降低濃度，將番石榴葉提取液和等量的雙倍濃度的營(yíng)養(yǎng)肉湯相混合，稀釋成濃度為500、250、125、62.5 mg/mL。取經(jīng)高壓滅菌后置55 ℃～60 ℃烘箱內(nèi)烘2 h 的濾紙片，分別置于番石榴葉提取物溶液中浸泡10 min，用鑷子鑷取濾紙圓片，在瓶壁上瀝去多余的溶液，放入菌液平板上。每種菌涂布3 個(gè)平板，每個(gè)平板中十字對(duì)稱放處理過(guò)的4 張濾紙圓片。記錄下菌編號(hào)、濾紙片的濃度編號(hào)和日期，細(xì)菌平板倒置35 ℃～37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h；觀察它的抑菌圈直徑，取3 只培養(yǎng)皿連續(xù)平行測(cè)試3 次，記錄平均值。

1.2.6 最低抑菌濃度的測(cè)定

采用平板劃線法[6-7]測(cè)定大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌的最低抑制濃度，在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)細(xì)菌，以有無(wú)菌生長(zhǎng)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，與對(duì)照組（菌落生長(zhǎng)正常）比較，有肉眼可見(jiàn)菌落者為無(wú)抑菌作用；無(wú)菌落生長(zhǎng)的番石榴葉提取物濃度為番石榴葉提取物的最低抑菌濃度（MIC）。把待測(cè)物用乙醇溶解稀釋成500、250、125、62.5 mg/mL，吸取各種濃度溶液1 mL，分別加入直徑8 mm 的培養(yǎng)皿中，每皿加入已融化的培養(yǎng)基9 mL，搖勻，靜置待凝后制成含有待測(cè)濃度供試樣品的平板。在培養(yǎng)皿上劃線接種，細(xì)菌平板倒置35℃～37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h 培養(yǎng)菌落，觀察個(gè)培養(yǎng)皿是否長(zhǎng)菌及菌落生長(zhǎng)情況。每種番石榴葉提取物濃度梯度做一組平行試驗(yàn)，以完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的最低濃度為番石榴葉提取物的MIC 值。

表2 番石榴葉提取物的抑菌作用定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Qualitative experimental result for inhibitory effect of Guava leaf extract

2 結(jié)果與分析

番石榴葉提取物的抑菌作用定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表2。

由表2 影像結(jié)果可以看出番石榴葉提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌都有抑菌效果。

表3 番石榴葉提取物抑菌作用結(jié)果Table 3 The result for inhibitory effect of Guava leaf extract

由表3 結(jié)果可知，番石榴葉子中的提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌的抑制作用很明顯，其中對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌抑制最強(qiáng)，抑菌圈直徑為13.5 mm、18.7 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，抑菌圈直徑為10.5 mm。

番石榴葉提取液最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表4。

從表4 可以看出：番石榴葉提取液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌都有明顯的抑菌作用，當(dāng)番石榴葉提取液濃度為1.25%時(shí)，大腸桿菌、沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)完全被抑制，培養(yǎng)皿中無(wú)菌落生長(zhǎng)，當(dāng)番石榴葉提取液濃度為2.5%時(shí)，枯草芽孢桿菌、志賀氏菌的生長(zhǎng)完全被抑制。該番石榴葉提取液的最低MIC 值為：大腸桿菌（MIC）1.25%，枯草芽孢桿菌（MIC）2.5%，金黃色葡萄球菌（MIC）5%，沙門(mén)氏菌（MIC）1.25%，志賀氏菌（MIC）2.5%。

表4 番石榴葉提取液最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果Table 4 Outcome measure for MIC of Guava leaf extract

3 結(jié)論與討論

由定性測(cè)試結(jié)果顯示，番石榴葉提取液各種濃度對(duì)供測(cè)試細(xì)菌如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌的抑制作用明顯。被抑制的細(xì)菌中既有革蘭氏陽(yáng)性菌，也有革蘭氏陰性菌；既有球菌，也有桿菌；抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，番石榴葉提取液對(duì)常見(jiàn)致病菌和腐敗菌具有明顯的抑制作用。其中對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌抑制效果最強(qiáng)，MIC=1.25%，抑菌圈直徑為18.7 mm、13.5 mm。對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，MIC=5%，抑菌圈直徑為23.5 mm。番石榴葉提取液作為天然抗氧化、抗菌主要成分之一，其安全性能極高，如將其用在食品中進(jìn)行防腐，其推廣和應(yīng)用必將帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

[1]陳新謙,金有豫,湯光.新編藥物學(xué)[M].15 版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2006：252

[2]李多,鄧述愷,陳思宇.抗菌藥物[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2007,11(8)：656

[3]陳祝群,例槲皮素型超敏遲緩相反應(yīng)的臨床報(bào)告[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2006,17(3)：70

[4]謝宗萬(wàn).全國(guó)中草藥匯編(上冊(cè))[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1996：882

[5]楊履渭,劉秉陽(yáng).微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù)(細(xì)菌對(duì)藥物敏感試驗(yàn))[M].廣州：廣東科技出版社,1992：440-447

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：附錄Ⅵ

[7]United state Inc.The United states pharmacopeia USP 27.NF22[S].Rockville,MD：United state pharmacopeia,2004：216