魯燕驊，楊麗仙，牛華，祝紅昆，珠娜

（1.云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650223；2.云南省計量測試技術研究院，云南 昆明 650228）

甲醛是一種具有強烈刺激性的無色氣體，易溶于水，其溶液常作為防腐劑。甲醛的稀釋溶液能使細胞原生質(zhì)的蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆凝固，并能使細胞的正常機能受到抑制，甚至破壞，是一種原生質(zhì)毒物。近幾年，我們在日常檢測工作中發(fā)現(xiàn)有不法從業(yè)者使用甲醛溶液對食用菌進行防腐處理，以延長食用菌的銷售周期，對食用者的健康產(chǎn)生極大威脅。目前，甲醛的測定方法有：分光光度法，該方法具有操作簡單等優(yōu)點，其缺點是定性準確度不夠，易產(chǎn)生假陽性；液相色譜法，均采用樣品直接衍生的處理方式，干擾較大，影響定量的準確性；氣相色譜法，其缺點是穩(wěn)定性和重現(xiàn)性不夠好。

本方法中樣品經(jīng)水蒸汽蒸餾，得到的蒸餾液經(jīng)柱前衍生，樣品中的甲醛與2，4-二硝基苯肼進行衍生化反應，生成甲醛-二硝基苯腙，用液相色譜進行分離，二極管陣列檢測器外標法定量測定，該物質(zhì)在350 nm下有最大吸收。該方法能夠有效降低干擾，準確度高，精密度好。

1 材料與方法

1.1 設備

安捷倫HP1100高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）：安捷倫；蒸餾裝置（含冷凝、接收裝置）。

1.2 試劑

甲醛：標準品，100 mg/L購自國家標物中心，使用前根據(jù)檢測要求稀釋成相應的標準工作溶液；乙腈（色譜純）；2，4-二硝基苯肼（分析純）；磷酸（分析純）；水為超純水（18.2 MΩ）。

1.3 試劑配制

1.3.1 0.3%2，4-二硝基苯肼溶液

稱取0.3 g 2，4-二硝基苯肼，用70 mL 85%磷酸溶解，用乙腈定容至100 mL（2，4-二硝基苯肼預先用25%乙腈溶液重結晶，提純。

1.3.2 10%磷酸溶液（體積比）

取10 mL磷酸至100 mL容量瓶，一邊搖動一邊緩慢加入水定容至刻度線。

1.4 方法

1.4.1 提取

稱取10 g樣品（精確到0.001 g）于50 mL燒杯中，加水30 mL 10%磷酸10 mL進行水蒸汽蒸餾，收集餾出液至100 mL。

1.4.2 衍生

移取上述餾出液10 mL至預先盛有20 mL乙腈的50 mL容量瓶中，加入0.5 mL 0.3%2，4-二硝基苯肼，用蒸餾水定容至刻度線，常溫下靜置4 h。經(jīng)0.45μm濾膜過濾后待測。

1.4.3 測定色譜條件

色譜柱：C18，200 mm×4.6 mm，5μm；檢測波長：350 nm；流動相：乙腈∶水=60∶40；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20μL。

2 結果與討論

2.1 提取

樣品經(jīng)磷酸酸化，水蒸氣蒸餾，已能將樣品中的甲醛完全蒸餾出來，若采用直火蒸餾，會使食用菌中糖類物質(zhì)分解成甲醛，影響測定結果。

2.2 衍生化反應

2.2.1 反應時間

衍生化反應后 2 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進行測定，發(fā)現(xiàn)該反應在4 h后達到穩(wěn)定值。

2.2.2 衍生試劑濃度

用0.1%、0.2%濃度的衍生試劑，反應12 h后，仍達不到一個平衡點，而用0.3%～0.4%濃度的衍生試劑衍生后，反應3 h～6 h，反應趨于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2.3 衍生化反應溫度

分別在 10、20、30、40、60、80 ℃下進行衍生化反應，發(fā)現(xiàn)10、20、30℃下衍生化反應基本完全，當溫度＞40℃時，衍生反應的效率有所下降，故本方法選擇在室溫下進行衍生化反應。

2.2.4 衍生化反應pH

當pH小于4時，可以抑制苯肼成鹽，保留一部分游離堿，使反應順利進行，通過對pH為1、2、3、4進行試驗，發(fā)現(xiàn)pH越低，反應速度越快，反應產(chǎn)物也相對偏高，但對于普通C18色譜柱來說，其使用范圍一般在pH 2～10之間，故從檢測效率，儀器維護，操作方便性等方面考慮，本方法采用0.3%的衍生試劑，pH=3的條件常溫下衍生反應4 h后進行測定。

2.3 檢測波長的選擇

經(jīng)二極管陣列檢測器波長掃描，甲醛-2，4二硝基苯腙在350 nm處有較大吸收。

2.4 流動相的選擇

選用乙腈∶水=60∶40（體積比）為流動相，可獲得較好的峰形和適當?shù)谋Ａ魰r間（見圖1），連續(xù)10次進樣，保留時間的RSD＜0.5。

圖1 標準樣品圖譜Fig.1 Standard sample diagram

2.5 方法線性關系和檢測限

將甲醛標準溶液分別稀釋成含甲醛：5、10、20、30、40、50μg的系列標準，在本方法所確定的實驗條件下進行測定，并繪制標準曲線，在此范圍內(nèi)，甲醛量與峰面積具有良好的線性關系，線性方程：y=4.551x+0.507，相關系數(shù)r=0.9999，甲醛的最小檢出量為2×10-8g，對于10 g樣品，最低檢出濃度為0.02 mg/kg。

2.6 方法回收率及精密度

分別添加 5.0、20.0、50.0μg甲醛于樣品中，按上述方法連續(xù)測定6次，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD），見表1。

表1 回收率試驗結果Table 1 The recovery rate experiments result

用上述方法對30批食用菌樣品進行檢測，結果滿意。

3 結論

本文綜合了國家標準、行業(yè)標準中甲醛測定方法的優(yōu)點，建立了一種能夠有效排除干擾、且保持較好準確度和較高精密度的檢測方法，可以用于食用菌中甲醛含量的日常檢測或結果驗證。

[1]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.SC/T 3025-2006水產(chǎn)品中甲醛的測定[S].2006：1-6

[2]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 1547-2011進出口食品中甲醛的測定液相色譜法[S].2011：1-5

[3]浙江省質(zhì)量技術監(jiān)督局.DB33/T 555—2005植物源食品中甲醛殘留量的測定高效液相色譜法[S].2005：1-3