李秋鳳，王金亭

（聊城大學(xué)東昌學(xué)院，山東聊城 252000）

刺槐（Robinia pseudoaeaeia L.）為豆科刺槐屬（Robinia）的代表性植物，起源于美國(guó)，17世紀(jì)傳入歐洲，我國(guó)于19世紀(jì)末從歐洲引人，故名洋槐[1]。紅花刺槐[R.pseudoacacia L.f.decaisneana（Carr.）Voss.]是刺槐的種間雜種（R.pseudoaeaeia×R.viseose）安比刺槐（R.ambigua）的一個(gè)栽培變種，是近幾年的引進(jìn)樹種，在我國(guó)南京、北京、大連、沈陽、上海、山東等地有栽培[2]。紅花刺槐用于園林綠化，不僅具有吸附灰塵、凈化空氣、減弱噪音、改善環(huán)境的作用，而且生長(zhǎng)迅速、干形冠色美觀，是良好的速生觀賞喬木。宋立功等研究表明[3]：紅花刺槐鮮枝葉粗蛋白含量為21.08%，高于沙棘葉粗蛋白含量4%，且富含多種維生素、微量元素及多種氨基酸，無刺、適口性好，可以作為飼用樹種廣泛推廣。在山東地區(qū)5月開花，花色艷麗，色素含量較高。文獻(xiàn)檢索表明，未見有關(guān)其紅色素的研究報(bào)道。本文利用微波輔助技術(shù)提取紅色素，并對(duì)微波功率、微波時(shí)間、料液比三因子進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，利用響應(yīng)面法（Response Surface Methodolog，RSM）優(yōu)化紅色素的最佳提取工藝參數(shù)，從而為該色素的提取提供理論參考。

1 材料與儀器

TU1800紫外可見分光光度計(jì)：北京普析；722E可見分光光度計(jì)：上海光譜；AR1140電子天平：美國(guó)奧豪斯；MG08S－2B連續(xù)微波處理器：南京匯研；RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮；PHS－3C酸度計(jì)：上海雷磁；FD－1B－50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康；所用試劑均為分析純。

刺槐紅花：采于聊城市區(qū)，由聊城大學(xué)生科院黃勇教授鑒定。收集紅花刺槐落花，風(fēng)干、去雜、粉碎、過60目篩備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色素的吸收光譜

稱取1.00 g紅花刺槐干花，以鹽酸乙醇（0.1 mol/L HCl∶95%乙醇=1∶99，體積比）為溶劑，常溫浸提 4 h，合并兩次濾液，離心取上清，真空濃縮，0.1 mol/L檸檬酸水溶液定容至100mL，紫外可見分光光度計(jì)在400nm～600 nm范圍內(nèi)掃描，確定可見光區(qū)最大吸收波長(zhǎng)λmax。

2.2 溶劑的選擇

分別選擇4種不同溶劑，按方法2.1實(shí)驗(yàn)，用722E可見分光光度計(jì)在548 nm處測(cè)量各樣品的吸光度。

2.3 單因素試驗(yàn)

稱取1.00 g紅花刺槐干花若干份，以鹽酸乙醇作提取劑，分別在不同的微波功率、微波時(shí)間、提取劑濃度、料液比等條件下做單因子平行試驗(yàn)，提取2次，0.1 mol/L檸檬酸水溶液定容至100 mL，用722E可見分光光度計(jì)在548 nm處測(cè)量各樣品的吸光度。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以微波時(shí)間（A）、微波功率（B）、料液比（C）3個(gè)因素與色素提取產(chǎn)量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化刺槐紅色素提取工藝。通過Design Expert V8.0.6.1軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)紅色素提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。

應(yīng)用改進(jìn)的Fuleki方法計(jì)算色素產(chǎn)率，調(diào)節(jié)色素提取液的pH至3.0，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后在535 nm下測(cè)定光密度（A535）值，按下列經(jīng)驗(yàn)公式[4]計(jì)算紅色素的提取產(chǎn)量（mg/g）。

式中：A535為色素在535 nm波長(zhǎng)處的吸光度；V為一定重量的干花提取色素時(shí)的定容體積，mL；n為比色時(shí)稀釋的倍數(shù)；98.2為花色苷色素在535 nm波長(zhǎng)處的平均消光系數(shù)；W為干花的重量，g。

2.5 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

稱取1.00 g紅花刺槐干花6份，1份～3份按單因素最佳條件提取，5份～6份用RSM優(yōu)化的工藝條件提取，反復(fù)提取5次至無色，按方法2.4計(jì)算色素產(chǎn)率。

3 結(jié)果與討論

3.1 最大吸收波長(zhǎng)

刺槐紅色素的紫外可見吸收光譜結(jié)果見圖1。

圖1 刺槐紅花色素的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-visible absorption spectrum of RFRP

由圖1可看出，紅花刺槐紅色素在可見光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)為λmax=548 nm。

3.2 溶劑選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，以鹽酸乙醇（0.1 mol/L HCl∶95%乙醇=1∶99體積比）為溶劑，提取效果最好，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的提取溶劑。

表1 溶劑選擇結(jié)果Table 1 Results of solvent selection

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 微波時(shí)間的選擇

按鹽酸乙醇、料液比 1∶30（g/mL）、室溫、500 W 的條件，分別以 20、30、40、50、60 s的微波處理時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)吸光值（表2）。由表2可知，在40 s時(shí)吸光度值最大，說明微波處理時(shí)間以40 s為佳。

3.2.2 微波功率的選擇

按鹽酸乙醇、料液比 1∶30（g/mL）、室溫、40 s的條件，分別采用 300、400、500、600、700 W 微波功率進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)吸光值（表2）。由表2可知，在500 W時(shí)吸光度值最大，說明微波功率以500 W為佳。

表2 單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of single factor

3.2.3 料液比的選擇

按鹽酸乙醇、室溫、40 s、500 W的條件，分別以1∶20、1∶30、1∶40 、1∶50、1∶60（g/mL）的料液比進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)吸光值（表 2）。由表 2 可知，在料液比 1∶40（g/mL）時(shí)提取效果較好。

3.2.4 提取劑濃度的選擇

按料液比 1∶40、室溫、40 s、500 W 的條件，分別采用55%、60%、75%、85%、95%的鹽酸乙醇做提取劑進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)吸光值（表2）。由表2可知，在提取劑為95%的鹽酸乙醇時(shí)提取效果較好，后續(xù)RSM實(shí)驗(yàn)采用95%鹽酸乙醇作為提取劑。

3.3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

3.3.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)分析

RSM分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Table 3 Experiments and extraction yield of red pigment with Box-Behnken software

利用Design Expert軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到紅色素提取產(chǎn)量預(yù)測(cè)值對(duì)編碼自變量A、B和C的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=119.00+1.10A－1.91B+4.63C－9.86A2－

17.33B2－6.47C2－11.28AB－2.12AC－0.81BC對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance with regression model

結(jié)果表明：模型是顯著的（P＜0.000 1），回歸模型的決定系數(shù)為0.977 4，說明該模型能夠解釋97.7%的變化，因此，可用此模型對(duì)刺槐紅色素提取產(chǎn)量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

3.3.2 紅色素提取產(chǎn)量的響應(yīng)面優(yōu)化

利用Design Expert軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖2～圖3。

圖2顯示，等高線呈橢圓形，表示微波時(shí)間和微波功率兩因素交互作用顯著[5－6]。在料液比為 1∶40（g/mL）時(shí)，微波時(shí)間與功率對(duì)紅色素提取產(chǎn)量影響較大。微波能可有效提高色素的浸出率[7]，適當(dāng)延長(zhǎng)微波處理時(shí)間或增加微波功率，可提高紅花刺槐色素的提取產(chǎn)量。但微波能過大，提取溫度過高，紅色素變得不穩(wěn)定，提取產(chǎn)量反而下降。

由圖3可知，微波處理時(shí)間和料液比的交互作用、微波功率和料液比的交互作用不顯著。在微波處理時(shí)間、微波功率相對(duì)固定時(shí)，在一定的料液比范圍內(nèi)，隨著料液比的增大，紅色素的提取產(chǎn)量有所增加。但料液比超過一定范圍后，色素的提取產(chǎn)量反而下降，可能是料液比過大時(shí)，色素濃度下降，色素分子間作用力變小，其穩(wěn)定性下降而容易分解，導(dǎo)致色素產(chǎn)量下降[8]。

圖2 微波功率和時(shí)間交互作用對(duì)刺槐紅花色素提取產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of interaction of the microwave power and time on the extraction yield of RFRP

圖3 A/C交互和B/C交互作用對(duì)刺槐紅花色素提取產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of interaction of the A/C and B/C on the extraction yield of RFRP

3.4 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Result of contrast test

由表5可看出，在優(yōu)化條件下提取紅色素，提取產(chǎn)量比微波輔助提取單因素最佳條件的提取產(chǎn)量高3.15%。

4 結(jié)論

用響應(yīng)面法對(duì)紅花刺槐紅色素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。建立的紅色素提取產(chǎn)量的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型具有顯著性（p＜0.000 1），決定系數(shù)為0.977 4。由模型可知：在微波處理時(shí)間為40.65s、微波功率為491.57W、料液比1∶43.53（g/mL）的條件下，紅色素最大提取產(chǎn)量預(yù)測(cè)值為119.934 mg/g，實(shí)際提取產(chǎn)量比微波輔助提取單因素最佳條件的提取產(chǎn)量高3.15%。

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