沈莎莎 楊紅建 任清長(zhǎng) 白薩茹拉 張曉明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

植酸酶(phytase)即六磷酸肌醇水解酶(myoinositol hexakisphosphate phosphohydrolase)，是通過水解植酸的磷酸單酯鍵生成低級(jí)磷酸肌醇和無機(jī)磷的一類酶的總稱［1］。目前，植酸酶作為一種新型的飼料添加劑，通常添加到單胃動(dòng)物或魚類的飼糧中用來降解植物性飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子——植酸，并釋放出無機(jī)磷以及與植酸結(jié)合的蛋白質(zhì)、微量元素等，進(jìn)而提高飼料磷利用效率和動(dòng)物生長(zhǎng)性能。與單胃動(dòng)物不同，反芻動(dòng)物能很大程度上依靠瘤胃微生物分泌的內(nèi)源性植酸酶來消化利用飼料中的植酸［1］。由于在反芻動(dòng)物特別是高產(chǎn)奶牛飼糧中富含植酸磷的谷物飼料所占比例很大，盲目額外添加磷酸氫鈣等無機(jī)磷所帶來的奶牛養(yǎng)殖磷排放環(huán)境污染問題備受關(guān)注。有研究認(rèn)為在飼糧中額外添加少量的植酸酶可以提高反芻動(dòng)物對(duì)飼料植酸磷的利用率［2］。但也有文獻(xiàn)研究認(rèn)為，瘤胃微生物在降解利用富含纖維飼料的同時(shí)可以依靠自身分泌的植酸酶來降解利用飼料中的植酸磷，從而可能無需在飼糧中額外添加植酸酶［3］。因此，作者采用短期人工瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)合動(dòng)態(tài)產(chǎn)氣實(shí)時(shí)記錄技術(shù)，分析了添加植酸酶對(duì)瘤胃微生物降解和利用稻糠、玉米麩和麥麩的功效，以期為今后通過開展飼養(yǎng)試驗(yàn)開發(fā)和研究植酸酶作為反芻動(dòng)物飼料添加劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵底物

本試驗(yàn)采集不同產(chǎn)地的糠麩飼料作為試驗(yàn)材料，對(duì)稻糠分別編號(hào)為RB1、RB2、RB3，玉米麩分別編號(hào)為 MB1、MB2、MB3，麥麩分別編號(hào)為WB1、WB2、WB3。飼料經(jīng)電熱鼓風(fēng)干燥箱65℃烘干48 h后粉碎過40目篩。并按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法［4］對(duì)試驗(yàn)飼料進(jìn)行粗蛋白質(zhì)(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和植酸磷含量的測(cè)定。

1.2 植酸酶處理方法

植酸酶樣品由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所贈(zèng)送，活性為5 000 U/g(1 U代表該植酸酶在反應(yīng)條件下作用于植酸鈉溶液，每分鐘可釋放出1μmol無機(jī)磷)。參照Engelen等［5］的酶處理方法，稱取0.5 g植酸酶溶解于100 mL乙酸緩沖液(稱取1.76 g乙酸、30.02 g 三水乙酸鈉、0.147 g 二水氯化鈣溶解于900 mL蒸餾水中，用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.50，并用蒸餾水定容至1 000 mL)，常溫下在磁力攪拌器上高速攪拌30 min，制成25 U/mL植酸酶工作液。

1.3 體外發(fā)酵

使用本實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)和設(shè)計(jì)的64通路AGRS-Ⅲ型體外發(fā)酵產(chǎn)氣自動(dòng)記錄裝置和軟件系統(tǒng)［6］進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定累積產(chǎn)氣量。

試驗(yàn)前，根據(jù)Menke等［7］的配方配制緩沖液，主要包括微量元素溶液、碳酸緩沖溶液、磷酸緩沖溶液、硫化鈉(Na2S)還原溶液以及刃天青指示劑。配制好的緩沖液混勻后持續(xù)通入CO230 min以上直至溶液pH達(dá)到6.8，置于39℃恒溫水浴鍋中備用。

稱取500 mg待測(cè)飼料于150 mL厭氧發(fā)酵瓶中，每種飼料設(shè)置對(duì)照組和加酶組。對(duì)照組設(shè)置3個(gè)平行，加酶組設(shè)置4個(gè)平行。于晨飼前1 h內(nèi)采集3頭安裝有永久瘤胃瘺管、平均日產(chǎn)奶量為20 kg的泌乳期成年荷斯坦奶牛的瘤胃液，等體積混勻后經(jīng)4層紗布過濾，濾液置于39℃恒溫水浴鍋中，持續(xù)通入CO2備用。

用移液器準(zhǔn)確移取50 mL緩沖液和25 mL瘤胃液于各發(fā)酵瓶中，并用微量移液器將100μL配制好的植酸酶工作液添加至加酶組發(fā)酵瓶中，通入CO2數(shù)秒，驅(qū)除液面上方空氣后蓋上瓶塞，立即與AGRS-Ⅲ型體外發(fā)酵產(chǎn)氣自動(dòng)記錄裝置各氣路通道相連，并于39℃條件下連續(xù)培養(yǎng)72 h，期間每12 h輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)基。

1.4 樣品收集與處理

連續(xù)發(fā)酵72 h后，關(guān)閉發(fā)酵產(chǎn)氣記錄系統(tǒng)，打開發(fā)酵瓶測(cè)定pH。將瓶?jī)?nèi)發(fā)酵液倒入經(jīng)烘干稱重的尼龍袋(孔徑200目)中過濾，采集濾液樣品。尼龍袋連同發(fā)酵剩余底物用蒸餾水漂洗后，在65℃下烘干至少48 h后稱重，根據(jù)發(fā)酵前飼料樣中的干物質(zhì)含量，利用差減法計(jì)算待測(cè)飼料體外發(fā)酵干物質(zhì)消失率(dry matter disappearance in vitro，IVDMD)。取1.0 mL發(fā)酵濾液在4℃條件下3 000×g離心5 min，收集上清液。取500μL上清液加入150μL 25%(質(zhì)量體積比)偏磷酸，混勻，4℃靜置30 min后在10 000×g離心15 min，取上清液待分析。

1.5 產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)模型分析

根據(jù)AGRS-Ⅲ裝置自動(dòng)記錄到的各發(fā)酵瓶的產(chǎn)氣時(shí)間和對(duì)應(yīng)的累積產(chǎn)氣量，參照?rskov等［8］提出的指數(shù)函數(shù)模型對(duì)不同飼料累積產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，得出:

式中:GPt為累積產(chǎn)氣量(mL/g，干物質(zhì)基礎(chǔ))，c為產(chǎn)氣速率(mL/h)，t為產(chǎn)氣時(shí)間(h)，lag為產(chǎn)氣延滯時(shí)間(h)，A為發(fā)酵底物在該產(chǎn)氣速率下的理論最大產(chǎn)氣量(mL)。

根據(jù)下式計(jì)算達(dá)到最大產(chǎn)氣量1/2時(shí)的產(chǎn)氣速率:

式中:AGPR為達(dá)到最大產(chǎn)氣量1/2時(shí)的產(chǎn)氣速率(mL/h)。

1.6 氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的測(cè)定

發(fā)酵液中氨態(tài)氮濃度的測(cè)定采用靛酚比色法［9］。VFA 含量的測(cè)定參照楊紅建等［10］的方法。非糖異生類短鏈脂肪酸(乙酸、丁酸)與糖異生類短鏈脂肪酸(丙酸、戊酸等)的比率按下式計(jì)算:非糖與糖異生的類短鏈脂肪酸比率(NGR)=(乙酸 +2×丁酸 +戊酸)/(丙酸 +戊酸)［11］。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003整理后，采用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件中GLM 過程進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏法和MEANS語句統(tǒng)計(jì)組間差異的顯著性，并利用LSMENAS語句統(tǒng)計(jì)各測(cè)定指標(biāo)最小二乘法均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。差異性顯著水平為P ＜0.050 0，差異極顯著水平為 P ＜0.000 1。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)發(fā)酵底物的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分

由表1可知，不同來源的同種糠麩飼料營(yíng)養(yǎng)成分存在較大差異，其中，稻糠中RB1的CP、植酸磷的含量均高于RB2、RB3，其 NDF和ADF的含量最低;麥麩中WB1也存在同樣的特性;玉米麩中MB1的CP和植酸磷的含量最高，NDF含量最低，ADF含量在3中飼料中居中。此外，稻糠、玉米麩和麥麩的營(yíng)養(yǎng)成分也不同。稻糠的CP含量最低，但其NDF和ADF的含量均高于玉米麩和麥麩。

表1 試驗(yàn)發(fā)酵底物的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Common nutrient composition of the experimental fermentation substrates(DM basis) %

2.2 添加植酸酶對(duì)3種糠麩飼料體外發(fā)酵參數(shù)的影響

由表2可知，玉米麩對(duì)照組的IVDMD顯著高于加酶組(P＜0.050 0)，而稻糠和麥麩對(duì)照組的IVDMD和加酶組差異均不顯著(P＞0.050 0)。飼料種類對(duì)IVDMD有極顯著影響(P＜0.000 1)，比較3種糠麩飼料發(fā)現(xiàn)，它們的IVDMD表現(xiàn)為玉米麩＞麥麩＞稻糠。而就植酸酶添加效果而言，添加5 U/g的植酸酶并不能顯著改變飼料IVDMD(P ＞0.050 0)。

除稻糠加酶組產(chǎn)氣速率顯著低于對(duì)照組外(P＜0.050 0)，同一飼料各發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)照組和加酶組的間均無顯著差異(P＞0.050 0)。比較稻糠、玉米麩和麥麩發(fā)現(xiàn)，飼料種類不同，72 h累積產(chǎn)氣量、理論最大產(chǎn)氣量及達(dá)到最大產(chǎn)氣量1/2時(shí)的產(chǎn)氣速率存在極顯著差異(P＜0.000 1)，產(chǎn)氣速率和產(chǎn)氣延滯時(shí)間存在顯著差異(P＜0.050 0)。此外，比較植酸酶的添加對(duì)飼料發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響發(fā)現(xiàn)，添加5 U/g植酸酶顯著降低了飼料產(chǎn)氣速率及達(dá)到最大產(chǎn)氣量1/2時(shí)的產(chǎn)氣速率(P＜0.050 0)。不同飼料及酶處理的累積產(chǎn)氣量動(dòng)態(tài)有明顯的不同，總體上保持玉米麩＞稻糠＞麥麩(圖1)。

2.3 添加植酸酶對(duì)3種糠麩體外瘤胃發(fā)酵特性的影響

由表3可知，對(duì)同一飼料而言，對(duì)照組和加酶組pH、NH3-N濃度、VFA含量(除異丁酸外)和NGR均未表現(xiàn)出顯著差異(P＞0.050 0)。植酸酶顯著提高了總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度(P＜0.050 0)，且TVFA濃度增幅由高至低依次為麥麩(4.2%)、稻糠(3.3%)、玉米麩(1.7%);從VFA含量來看，植酸酶顯著提高了異丁酸含量(P＜0.050 0)，異戊酸和戊酸的含量有提高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P＞0.050 0)。此外，添加植酸酶也不能顯著改變NGR(P＞0.050 0)。

比較稻糠、玉米麩和麥麩3種飼料發(fā)現(xiàn)，各種VFA的含量不同飼料間存在較大的差異。丁酸和異戊酸含量飼料間不存在顯著差異(P＞0.050 0)，飼料種類不同，異丁酸含量存在顯著差異(P＜0.050 0)，乙酸、丙酸和戊酸含量均存在極顯著差異(P＜0.000 1)。乙酸含量稻糠＞麥麩＞玉米麩，丙酸和戊酸的含量均為玉米麩＞麥麩＞稻糠。

3 討論

飼料有機(jī)物的消化率與體外培養(yǎng)的產(chǎn)氣量之間存在較高的相關(guān)性，即產(chǎn)氣量越高，飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵程度越高［12］。本試驗(yàn)以稻糠、玉米麩和麥麩為發(fā)酵底物，采用短期人工瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)合動(dòng)態(tài)產(chǎn)氣實(shí)時(shí)記錄技術(shù)，發(fā)現(xiàn)3種糠麩飼料微生物消化率表現(xiàn)為玉米麩 ＞麥麩 ＞稻糠，符合Nsahlai等［13］研究指出的理論最大產(chǎn)氣量與飼料本身NDF含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與CP含量呈正相關(guān)的規(guī)律。但額外添加植酸酶除可顯著降低產(chǎn)氣速率外，并未顯著影響飼料體外發(fā)酵累積產(chǎn)氣量和理論最大產(chǎn)氣量。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)額外添加植酸酶對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣量影響未見報(bào)道，研究多集中添加植酸酶提高飼料植酸磷的降解利用效率上。Kincaid等［2］發(fā)現(xiàn)在奶牛全混合日糧中額外添加427 U/kg植酸酶能明顯提高飼料植酸磷的降解和總磷的利用率，但奶牛的干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶效率均不受植酸酶的影響。Bravo等［14］在泌乳山羊和干奶期奶牛飼糧中額外添加真菌植酸酶(2 000 IU)，并利用尼龍袋技術(shù)研究豆粕和菜籽粕的干物質(zhì)降解率和磷在瘤胃中的降解率時(shí)指出，添加真菌植酸酶有降低豆粕干物質(zhì)降解率的趨勢(shì)，但對(duì)菜籽粕的干物質(zhì)降解率沒有影響。本試驗(yàn)通過比較對(duì)照組和加酶組IVDMD發(fā)現(xiàn)，在稻糠、玉米麩和麥麩中額外添加5 U/g植酸酶有降低其IVDMD的趨勢(shì)，且玉米麩IVDMD的變化最顯著，與 Bravo 等［14］結(jié)果相似。

表2 植酸酶對(duì)糠麩飼料體外發(fā)酵72 h干物質(zhì)消失率、產(chǎn)氣量及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table 2 Effects of phytase on IVDMD，gas production and fermentation kinetic parameters of grain brans after fermented for 72 h

圖1 體外發(fā)酵累積產(chǎn)氣量動(dòng)態(tài)曲線Fig.1 The dynamic curve of accumulative gas production of fermentation in vitro

飼料在瘤胃微生物的作用下可產(chǎn)生大量的乙酸、丙酸及丁酸等VFA，它們是反芻動(dòng)物的主要能量來源，可提供反芻動(dòng)物總能量需要量的70%～80%［15］。本試驗(yàn)通過測(cè)定發(fā)酵液中的各種 VFA含量發(fā)現(xiàn)，雖然與對(duì)照組相比，額外添加植酸酶并未顯著影響3種糠麩飼料發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸含量，但從整體來看，乙酸的含量較高，為66.42% ～71.10%;丙酸含量偏低，為 12.26% ～16.35%;丁酸含量也在10%左右。額外添加植酸酶卻顯著增加了異丁酸的含量，同時(shí)也顯著提高了飼料發(fā)酵后TVFA濃度。該結(jié)果與Bravo等［14］的結(jié)果稍有不同，該研究通過測(cè)定乙酸、丙酸和丁酸3種主要的短鏈VFA含量指出，在泌乳山羊飼糧中額外添加真菌植酸酶并不能顯著影響乙酸含量和乙酸/丙酸，卻顯著提高了丙酸的含量(從23.4%提高至28.4%)以及顯著降低了丁酸的含量(從16.3%降低至12.4%)，不過這種 VFA含量的變化可能是因?yàn)樵诿谌樯窖蝻暭Z中添加了70%的精料。戊酸、異丁酸、異戊酸分別是飼料的蛋白質(zhì)中纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的微生物發(fā)酵產(chǎn)物［16］，在本試驗(yàn)中這3種VFA在添加植酸酶后都有不同程度的提高，尤其是異丁酸含量顯著升高，從一定程度上說明添加植酸酶促進(jìn)了瘤胃微生物對(duì)飼料中上述3種氨基酸的代謝，在后續(xù)的研究中應(yīng)注意瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成量的測(cè)定。此外，本試驗(yàn)根據(jù)測(cè)得的乙酸、丙酸、丁酸及戊酸含量計(jì)算得出的NGR與Zhang等［17］用羊草∶玉米為4∶1的混合飼料底物進(jìn)行體外瘤胃發(fā)酵48 h后測(cè)得的未添加任何甲烷抑制劑的對(duì)照組NGR(3.83)相比結(jié)果偏高，但與 Yang等［18］利用不同碳源和氮源組合的培養(yǎng)基研究新麗鞭毛菌(Neocallimastix sp.YQ1)以苜蓿作為木質(zhì)纖維性底物時(shí)的纖維降解活性試驗(yàn)中測(cè)得的 NGR(4.9～6.5)相近。本試驗(yàn)結(jié)果表明糠麩飼料在瘤胃微生物發(fā)酵作用下生糖前體物——丙酸含量較低，而非生糖前體物或乳脂前體物——乙酸和丁酸含量較高。

表3 植酸酶對(duì)糠麩飼料體外瘤胃發(fā)酵特性的影響Table 3 Effects of phytase on rumen fermentation characteristics of grain brans in vitro

4 結(jié)論

稻糠、玉米麩和麥麩間體外瘤胃發(fā)酵特性存在差異，添加5 U/g植酸酶可在一定程度上促進(jìn)瘤胃微生物發(fā)酵釋放出更多的VFA，提高瘤胃微生物對(duì)飼料中能量物質(zhì)的發(fā)酵利用效率。

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