董曉麗 張乃鋒 周 盟，2 屠 焰 刁其玉* 聶明非

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，烏魯木齊 830052)

自20世紀(jì)50年代以來(lái)，抗生素開(kāi)始廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，其在保證動(dòng)物健康、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、節(jié)約飼料成本、提高經(jīng)濟(jì)效益等方面做出了巨大的貢獻(xiàn)。近些年來(lái)，由于抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的長(zhǎng)期使用，毒副作用和藥物殘留已影響到人類(lèi)健康［1］。2006年，歐盟已經(jīng)全面禁止了飼料中抗生素的使用，美國(guó)和日本等國(guó)家也對(duì)其做出了嚴(yán)格的限制。2011年，韓國(guó)全國(guó)禁止在動(dòng)物飼料中添加抗生素。

隨著人們對(duì)畜產(chǎn)品安全的不斷重視以及環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷加強(qiáng)，益生菌作為抗生素的替代品備受關(guān)注，并越來(lái)越多地應(yīng)用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)和飼料中。益生菌是一類(lèi)能改善動(dòng)物胃腸道微生態(tài)平衡，有益于動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能發(fā)揮的微生物添加劑［2］。益生菌的作用效果主要表現(xiàn)在改善動(dòng)物新陳代謝、提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用、提高免疫力、減少環(huán)境污染等方面［3－4］。乳酸菌能夠調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的平衡，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力和抵抗力，促進(jìn)腸道的生長(zhǎng)和發(fā)育，是得到廣泛應(yīng)用的益生菌之一［5］。近年來(lái)，大量研究從菌株的安全性、抗病原菌的活性、耐酸和膽鹽及對(duì)胃腸道的耐受性等方面進(jìn)行體外評(píng)價(jià)益生菌的益生效果［6－8］。

本研究從北京大興種豬場(chǎng)附近土壤中分離得到一株抑制大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生長(zhǎng)的乳酸菌，編號(hào)為GF103。試驗(yàn)利用分子生物學(xué)手段鑒定乳酸菌GF103的菌種屬性，并通過(guò)體外法評(píng)價(jià)其作為益生菌的益生效果，以期篩選出具有益生作用的乳酸菌，為替代抗生素提供選擇。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

菌株來(lái)源:采集于北京市大興種豬場(chǎng)附近土壤。

MRS液體培養(yǎng)基:大豆蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸提物5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉 5 g，磷酸氫二鉀 2 g，硫酸鎂 0.1 g，硫酸錳0.05 g，吐溫80 1 mL，用去離子水定容至1 000 mL，pH 為6.4，121 ℃滅菌 20 min。

MRS固體培養(yǎng)基:大豆蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸提物5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉 5 g，磷酸氫二鉀 2 g，硫酸鎂 0.1 g，硫酸錳0.05 g，吐溫80 1 mL，瓊脂15 g，用去離子水定容至1 000 mL，pH 為6.4，121 ℃滅菌20 min。

肉湯培養(yǎng)基:牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，用去離子水定容至 1 000 mL，pH 為 7.2，121℃滅菌20 min。

指示菌:大腸桿菌K88(Escherichia coli IVDC C83901)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus IVDC C56005)。指示菌購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物保藏中心。

1.2 菌株分離與純培養(yǎng)

取1 g土壤樣品置于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中［9］，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。取1 mL 培養(yǎng)液與滅菌生理鹽水倍比稀釋成 10－6、10－7、10－83個(gè)濃度梯度，取100μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24 h。用滅菌牙簽挑取單菌落接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，然后用接種針進(jìn)行MRS固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h。最后，挑取單株菌落接種于200 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，獲得單株乳酸菌培養(yǎng)液，4℃保存。

1.3 菌株的抗病原菌特性篩選

應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散的牛津杯法篩選具有抑菌活力的乳酸菌。將肉湯培養(yǎng)基中加入瓊脂后，溶解均勻，高壓滅菌，冷卻到50℃左右，每20 mL培養(yǎng)基加入20μL新鮮培養(yǎng)的指示菌(108CFU/mL)，混勻倒入培養(yǎng)皿冷卻。用滅菌的鑷子將無(wú)菌的牛津杯輕輕的放入培養(yǎng)皿中，在牛津杯中分別加入80μL單株乳酸菌培養(yǎng)液，另一個(gè)牛津杯中加入80μL無(wú)菌的MRS液體培養(yǎng)基作對(duì)照，37℃培養(yǎng)24 h。篩選出能夠抑制指示菌的乳酸菌培養(yǎng)液，編號(hào)為GF103。其菌株稱(chēng)為乳酸菌GF103。

1.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定

取10 mL乳酸菌GF103培養(yǎng)液，低速離心獲得菌體。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒［DP302，天根生化科技(北京)有限公司)提取細(xì)菌總DNA。

以10 ng純化的細(xì)菌總DNA作為模板，擴(kuò)增16S rRNA基因。所用引物為原核生物16S rRNA基因的通用引物:27F:5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和1492R:5'-TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。引物由北京博邁德科技發(fā)展有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為50μL，包括0.5μL Taq酶(0.5 U/mL)、5.0 μL 10 × Buffer、4.0 μL dNTP Mixture、1.0 μL 模板 DNA、1.0 μL 正向引物 27F(25 μmol/L)、1.0 μL 反 向 引 物 1492R(25 μmol/L)和37.5μL 重蒸水(ddH2O)，擴(kuò)增條件:95℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán);72℃ 7 min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物全序列由北京博邁德科技發(fā)展有限公司測(cè)定。

1.5 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

根據(jù)16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果，使用Blast比對(duì)初步確定菌種。結(jié)合GenBank中乳酸菌屬(Lactobacillus)中其他菌種的16S rRNA基因序列，利用MEGA 3.0軟件，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 菌株的生長(zhǎng)曲線及p H變化

將乳酸菌GF103培養(yǎng)液按1%(V/V)接種于裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，37℃進(jìn)行培養(yǎng)，從0 h開(kāi)始每隔2 h取3個(gè)試管(3個(gè)平行)，24 h后分別于30、36、48 h各取3管，4℃保存。最后測(cè)定每管的pH和600 nm下的OD值(OD600nm)。

1.7 菌株耐酸和耐膽鹽特性

為了檢測(cè)乳酸菌GF103在低pH下的生長(zhǎng)狀態(tài)，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基為不同pH 梯度，分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.4。乳酸菌GF103培養(yǎng)液按1%(V/V)分別接種于不同pH的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600nm。

在MRS液體培養(yǎng)基中加入豬膽鹽，使其濃度分別為 0(對(duì)照)、0.15%、0.30% 和 0.60% 。乳酸菌GF103培養(yǎng)液接種于上述不同濃度的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)。

1.8 菌株抗人工胃腸液的耐受性

人工胃液的配制［10］:9.5% ～ 10.5% 的鹽酸16.4 mL，加水稀釋?zhuān)?pH 達(dá) 3.0。每 100 mL 溶液中加入1.0 g胃蛋白酶，混勻，用0.2μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾。

人工腸液的配制［10］:稱(chēng)取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL溶解，用0.4%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.8，加水稀釋至1 000 mL，每100 mL液體中加入1.0 g胰蛋白酶，混勻，用0.2μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾。

將乳酸菌GF103培養(yǎng)液分別接種于人工胃液或人工腸液中，37℃、140 r/min搖床培養(yǎng)，分別在0、30、180 min進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行的平均值，數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步處理后，利用SAS 8.01統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA進(jìn)行分析，差異顯著性用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌的分離篩選

抗病原菌試驗(yàn)顯示，篩選出的乳酸菌GF103能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)(圖1)。

圖1 乳酸菌GF103的抗病原菌特性Fig.1 Antimicrobial property of Lactobacillus sp.GF103

2.2 16S r RNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

乳酸菌GF103 16S rRNA基因測(cè)序后，提交到GenBank，獲得序列登錄號(hào)為JQ411248。測(cè)得序列進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果該菌株與GenBank中的Lactobacillus plantarum strain 033(登 錄 號(hào):JN560899.1)相似性為99%。將乳酸菌 GF103 16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的部分細(xì)菌的16S rRNA基因序列(菌株號(hào)見(jiàn)發(fā)育樹(shù))進(jìn)行同源性比對(duì)，應(yīng)用MEGA 3.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。結(jié)果顯示，乳酸菌GF103與植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)親緣關(guān)系最近，其次是短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，消化乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)。初步確定乳酸菌GF103為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。

2.3 菌株的生長(zhǎng)曲線和p H變化

將乳酸菌GF103培養(yǎng)液按1%(V/V)接種后，每隔2 h取樣測(cè)定發(fā)酵液的pH及OD600nm，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600nm為縱坐標(biāo)繪制菌株生長(zhǎng)曲線(圖3)，并以pH為縱坐標(biāo)制作pH的變化曲線(圖4)。從圖3可以看出，乳酸菌GF103的生長(zhǎng)曲線幾乎看不到延滯期，在培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)8 h時(shí)，生長(zhǎng)速度降低，但是仍然緩慢生長(zhǎng)，培養(yǎng)12 h后開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)48 h未見(jiàn)到衰亡期。這與圖4所示的隨著時(shí)間推移，菌液的pH變化趨勢(shì)相符合。即乳酸菌GF103生長(zhǎng)的前8 h時(shí)，菌液的pH迅速下降，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)較快，發(fā)酵產(chǎn)生的酸較多;12 h后，pH趨于穩(wěn)定。

2.4 菌株的耐酸性和耐膽鹽的特性

從圖5可以看出，乳酸菌GF103在pH=5以上生長(zhǎng)正常;在pH=3和4時(shí)，活菌數(shù)稍微下降，仍保留大量活菌數(shù);在pH=2時(shí)，活菌數(shù)顯著下降，菌株的生長(zhǎng)受到影響。

乳酸菌GF103在膽鹽濃度為0.15%、0.30%下生長(zhǎng)狀況很好，與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05);在濃度為0.60%膽鹽中生長(zhǎng)時(shí)，活菌數(shù)極顯著下降(P＜0.01，表1)。由此可以看出，乳酸菌GF103能夠耐受0.3%濃度的膽鹽。

2.5 菌株對(duì)人工胃腸液的耐受性

從表2可以看出，乳酸菌GF103在人工胃液中生長(zhǎng)0.5 h時(shí)，活菌數(shù)不受影響(P ＞0.05)，生長(zhǎng)3 h時(shí)活菌數(shù)降低大約1 log值(P＜0.01);乳酸菌GF103在人工腸液中生長(zhǎng)3 h，活菌數(shù)沒(méi)有顯著變化(P＞0.05)，能夠完全抵抗人工腸液的影響。

3 討論

目前，生產(chǎn)中使用的飼用微生物添加劑較多，常用的菌種有芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌等。本研究用MRS培養(yǎng)基分離出單株乳酸菌培養(yǎng)液，并篩選出能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的乳酸菌GF103，通過(guò)16S rRNA基因序列分析鑒定其為植物乳桿菌。

微生物典型生長(zhǎng)曲線分為延滯期(適應(yīng)期)、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)時(shí)期［11］，一般微生物制劑的研制中，常采集其生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期中后期和穩(wěn)定期的菌液。了解菌株的生長(zhǎng)曲線以便培養(yǎng)適當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)間的菌液。從乳酸菌GF103生長(zhǎng)曲線中可以看出，在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10 h后活菌數(shù)較高，穩(wěn)定性很好，且菌液的pH達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)，適合用于制備微生物添加劑。

圖2 依據(jù)16S r RNA序列構(gòu)建的乳酸菌GF103和同屬相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Lactobacillus sp.GF103 and related Lactobacillus sp.based on 16S rRNA sequence

圖3 乳酸菌GF103的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of Lactobacillus sp.GF103

圖4 乳酸菌GF103生長(zhǎng)的pH變化Fig.4 The pH variation of Lactobacillus sp.GF103

圖5 不同p H下乳酸菌GF103的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth of Lactobacillus sp.GF103 under different pH conditions

益生菌要耐受胃環(huán)境低pH，才可能進(jìn)入動(dòng)物腸道存活并增殖，發(fā)揮其益生作用［12］。通過(guò)耐酸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳酸菌GF103在pH=2時(shí)受到嚴(yán)重影響，活菌數(shù)嚴(yán)重下降，但在pH=3時(shí)，能保持大量的活菌數(shù)。據(jù)吳惠芬等［13］報(bào)道，仔豬出生時(shí)胃內(nèi)pH在5～6之間，2月齡前胃內(nèi)pH保持在3左右。因此，乳酸菌GF103能夠耐受動(dòng)物胃內(nèi)低酸環(huán)境。膽鹽的耐受性也是檢測(cè)益生菌益生作用的重要指標(biāo)。豬消化道中的膽鹽含量為 0.03% ～0.30%［14］，十二指腸中的膽汁酸鹽對(duì)外源細(xì)菌具有抑制作用，細(xì)菌在腸道的存活和增殖，必須能夠耐受0.3%膽鹽的環(huán)境［15］。前期研究表明，一些乳酸菌能夠耐受一定濃度的膽鹽［16－17］。本研究中，乳酸菌GF103在膽鹽濃度為0.3%濃度下生長(zhǎng)狀況與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，即能夠耐受動(dòng)物體內(nèi)膽鹽等形成的高滲透壓環(huán)境。

表1 乳酸菌GF103在不同濃度膽鹽中培養(yǎng)24 h的活菌數(shù)Table 1 Viable counts of Lactobacillus sp.GF103 in bile salt with different concentrations after 24 h

表2 乳酸菌GF103在人工胃腸液中的活菌數(shù)Table 2 Viable counts of Lactobacillus sp.GF103 in simulated gastrointestinal fluid

耐酸試驗(yàn)驗(yàn)證了乳酸菌GF103能夠耐受胃內(nèi)低酸環(huán)境。但是胃中還有胃蛋白酶等一些其他因素的影響。于是筆者通過(guò)人工模擬胃液檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)狀況，乳酸菌GF103在人工胃液中生長(zhǎng)0.5 h活菌數(shù)不受影響，3 h活菌數(shù)降低1 log值。乳酸菌GF103能夠在人工模擬胃液中存活，由此筆者推測(cè)該菌株作為益生菌能夠順利通過(guò)胃環(huán)境而不至于導(dǎo)致活性完全損失。乳酸菌在動(dòng)物胃腸道存活和增殖的另一個(gè)瓶頸就是必須能夠經(jīng)受小腸液對(duì)菌體的破壞作用［9］，抵制膽鹽和胰液素對(duì)它的毒害作用。耐膽鹽的試驗(yàn)已經(jīng)證明乳酸菌GF103能夠耐受動(dòng)物體內(nèi)最高膽鹽濃度0.3%。模擬人工腸液的試驗(yàn)證明，乳酸菌GF103能夠耐受小腸液的環(huán)境，從而為菌株在腸道中存活和增殖成為可能。目前已有很多報(bào)道［18－20］，利用體外方法篩選出能夠耐酸、耐膽鹽，并能抵抗人工模擬胃腸道液的益生菌，如芽孢桿菌、乳酸菌等，并通過(guò)飼喂動(dòng)物證明其能夠提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能、減少腹瀉、改善動(dòng)物免疫力等。

4 結(jié)論

綜合本試驗(yàn)的結(jié)果得知，乳酸菌GF103對(duì)病原菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。通過(guò)16S rRNA基因序列分析鑒定乳酸菌GF103屬于植物乳桿菌。體外評(píng)價(jià)其具有益生菌的耐酸、耐膽鹽的特性，能適應(yīng)動(dòng)物胃腸道內(nèi)環(huán)境。因此，可進(jìn)一步研究其作為微生物添加劑對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響。

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