解俊美 王 安

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030)

維生素D是動(dòng)物所必需的營(yíng)養(yǎng)素，在促進(jìn)動(dòng)物鈣、磷吸收以及骨骼發(fā)育等方面具有重要作用［1－2］。近幾年研究認(rèn)為，維生素 D還具有其他廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如對(duì)免疫機(jī)能的促進(jìn)作用、參與協(xié)調(diào)機(jī)體抗氧化的作用等［3］，已成為一種十分重要的營(yíng)養(yǎng)素［4］。目前，我國(guó)還未正式出臺(tái)蛋鴨完整的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，因此對(duì)蛋鴨維生素D需要量研究具有重要意義。本試驗(yàn)擬通過(guò)在飼糧中添加不同水平的維生素D，研究其對(duì)1～28日齡蛋雛鴨免疫及抗氧化功能的影響，尋求蛋鴨飼糧中維生素D的適宜添加量，為蛋鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選用健康、平均體重為(39.21±0.47)g的1日齡金定蛋雛鴨180只(已鑒定，均為母鴨)，隨機(jī)分成5組(Ⅰ～Ⅴ組)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只鴨。

1.2 試驗(yàn)飼糧與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)采用玉米－豆粕型基礎(chǔ)飼糧，參照NRC(1998)和臺(tái)灣畜牧學(xué)會(huì)(1993)建議的蛋鴨營(yíng)養(yǎng)需要配制。Ⅰ組(對(duì)照組)試?guó)嗭曃够A(chǔ)飼糧，Ⅱ～Ⅴ組試?guó)喎謩e飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加110、220、550、1 000 IU/kg維生素 D 的試驗(yàn)飼糧。維生素D以維生素D3(500 000 IU/g)的形式添加。試驗(yàn)期4周(1～28日齡)。全期自由采食和飲水，保證足夠的光照，且各試驗(yàn)組其他條件均保持一致，其余管理同蛋鴨常規(guī)飼養(yǎng)管理?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 樣品采集與處理

試驗(yàn)至第28天，從每個(gè)重復(fù)中選取健康、接近平均體重的試?guó)?只，空腹稱(chēng)活重后頸靜脈采血3 mL左右，所采血液靜置后3 000 r/min離心15 min，收集血清分裝于EP管中，－20℃貯存?zhèn)溆?。采血完成后將試?guó)嗩i動(dòng)脈放血屠宰，摘取肝臟(不包括膽囊)，－20℃保存待用;摘取免疫器官(脾臟、胸腺、法氏囊)，電子天平(0.01 g)稱(chēng)重。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 免疫器官指數(shù)的計(jì)算

免疫器官(胸腺、脾臟、法氏囊)指數(shù)(%)=(免疫器官重量/活體重)×100。

1.4.2 血清免疫指標(biāo)的測(cè)定

血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量采用日立CL7170型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。血清白細(xì)胞介素－2(IL-2)含量采用放射免疫法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自北京福瑞生物工程公司。

1.4.3 血清及肝臟抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

肝臟中蛋白質(zhì)含量，血清及肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPx)活性、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量均采用UV－2401紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，測(cè)定方法參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。對(duì)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行回歸分析，采用曲線估計(jì)法建立二次回歸模型:Y=a X2+b X+c，當(dāng)獲得顯著性二次效應(yīng)時(shí)，確定曲線拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的維生素D添加水平即為維生素D的適宜添加量。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨免疫器官指數(shù)的影響

由表2可知，胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均隨飼糧維生素D添加水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均以Ⅳ組為最高，與Ⅰ組差異顯著(P＜0.05)，與其他各組均差異不顯著(P＞0.05)。法氏囊指數(shù)各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但以Ⅲ組為最高。

通過(guò)二次曲線回歸模型，建立飼糧維生素D添加水平與胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)間的二次曲線回歸方程:Y1= －3.7 ×10－7X2+0.000 4X+0.275 1(R2=0.993 1，P ＜0.01);Y2= －1.9 ×10－7X2+0.000 2X+0.067 9(R2=0.949 0，P ＜0.05)。式中:X為飼糧維生素D添加水平;Y1、Y2分別為胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。由上述回歸方程求得維生素D 的適宜添加量分別為 540.5、526.3 IU/kg。

表2 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨免疫器官指數(shù)的影響Table 2 Effects of dietary vitamin D level on immune organ indices of egg-type ducklings

2.2 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨血清免疫指標(biāo)的影響

由表3可知，血清TP含量隨飼糧維生素D添加水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中Ⅲ和Ⅳ組顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組(P＜0.05)，其他各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。血清ALB含量隨飼糧維生素D添加水平的升高亦呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中Ⅳ組顯著高于Ⅰ、Ⅴ組(P＜0.05)，Ⅲ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組間差異不顯著(P＞0.05)。血清IL-2含量隨飼糧維生素D添加水平的升高基本呈下降趨勢(shì)，其中Ⅳ和Ⅴ組顯著低于Ⅰ組(P ＜0.05)。

通過(guò)二次曲線回歸模型，建立飼糧維生素D添加水平與血清TP、ALB含量間的二次曲線回歸方程:Y3= － 4.3 × 10－5X2+0.044 1X+29.174(R2=0.966 0，P ＜0.05);Y4= －9.0 ×10－5X2+0.009 6X+15.087(R2=0.958 4，P ＜ 0.05)。式中:X為飼糧維生素D添加水平;Y3、Y4分別為血清TP、ALB含量。由上述回歸方程求得維生素D的適宜添加量分別為 512.8、533.3 IU/kg。

表3 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨血清免疫指標(biāo)的影響Table 3 Effects of dietary vitamin D level on serum immune indices of egg-type ducklings

2.3 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨抗氧化指標(biāo)的影響

2.3.1 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨血清和肝臟SOD、GSH-Px活性的影響

由表4可知，血清和肝臟SOD活性隨飼糧維生素D添加水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組血清SOD活性顯著高于Ⅰ、Ⅱ組(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組間差異不顯著(P ＞0.05);Ⅳ組肝臟 SOD活性顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)，其他組間差異不顯著(P ＞0.05)。Ⅲ、Ⅳ組血清GSH-Px活性顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組(P＜0.05)，其他組間差異不顯著(P＞0.05)。Ⅳ組肝臟GSH-Px活性顯著高于其他各組(P＜0.05)，且Ⅲ、Ⅳ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)，但Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ組間差異不顯著(P＞0.05)。

通過(guò)二次曲線回歸模型，建立飼糧維生素D添加水平與肝臟SOD活性間的二次曲線回歸方程:Y5= － 3.3 × 10－5X2+0.035 0X+103.14(R2=0.972 4，P ＜0.05)。式中:X 為飼糧維生素D添加水平;Y5為肝臟SOD活性。由上述回歸方程求得維生素D的適宜添加量為530.3 IU/kg。

表4 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨血清和肝臟GSH-Px、SOD活性的影響Table 4 Effects of dietary vitamin D level on activities of GSH-Px and SOD in serum and liver of egg-type ducklings

2.3.2 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨血清和肝臟T-AOC、MDA含量的影響

由表5可知，血清和肝臟T-AOC均以Ⅳ組最高，其中Ⅲ、Ⅳ組血清T-AOC顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組(P＜0.05);Ⅲ、Ⅳ組肝臟T-AOC顯著高于Ⅰ、Ⅴ組(P＜0.05)。血清和肝臟MDA含量均以Ⅳ組最低，并顯著低于其他各組(P＜0.05)。

通過(guò)二次曲線回歸模型，建立維生素D添加水平與血清T-AOC、肝臟T-AOC和血清MDA含量間的二次曲線回歸方程:Y6=－3.4×10－6X2+0.009 1X+8.121 1(R2=0.985 7，P ＜ 0.05);Y7= －3.4 ×10－6X2+0.003 4X+1.980 7(R2=0.952 0，P ＜ 0.05);Y8=6.6 × 10－6X2－0.006 9X+7.153 2(R2=0.980 1，P ＜0.05)。式中:X為飼糧維生素D添加水平;Y6、Y7和Y8分別為血清T-AOC、肝臟T-AOC和血清MDA含量。由上述回歸方程求得維生素D的適宜添加量分別為 523.0、550.0、522.7 IU/kg。

表5 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨血清和肝臟T-AOC、MDA含量的影響Table 5 Effects of dietary vitamin D level on T-AOC and MDA content in serum and liver of egg-type ducklings

3 討論

3.1 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨免疫器官發(fā)育的影響

胸腺、脾臟、法氏囊等免疫器官是動(dòng)物執(zhí)行免疫功能的組織機(jī)構(gòu)，在機(jī)體免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，其生長(zhǎng)發(fā)育直接影響著機(jī)體免疫力的高低。免疫器官指數(shù)的提高意味著免疫系統(tǒng)發(fā)育較快，免疫功能較強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)影響顯著，對(duì)法氏囊指數(shù)影響不顯著，這與王麗等［5］報(bào)道結(jié)果一致。馮永淼等［6］研究表明，飼糧維生素D添加水平在500～2 500 IU/kg范圍內(nèi)，肉雞免疫器官發(fā)育良好。經(jīng)回歸分析，本試驗(yàn)得出，當(dāng)維生素D的添加量分別為540.5、526.3 IU/kg時(shí)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)達(dá)到最大。由此可見(jiàn)，飼糧添加適量維生素D促進(jìn)了蛋雛鴨免疫器官的發(fā)育及其良好生長(zhǎng)，直接增強(qiáng)了機(jī)體的免疫功能。

3.2 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨血清免疫指標(biāo)的影響

血清TP、ALB含量反映了機(jī)體蛋白質(zhì)的吸收和代謝狀況。血清TP由肝臟合成，其含量的高低直接反映出動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育及生理狀態(tài)，TP含量高是蛋白質(zhì)代謝旺盛的表現(xiàn)，有利于動(dòng)物生長(zhǎng)。血清中ALB的主要功能是維持滲透壓平衡，與機(jī)體免疫功能相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧維生素D添加水平可顯著影響血清TP和ALB含量，維生素D添加水平為512.8 IU/kg時(shí)血清TP含量達(dá)到最高。血清TP含量升高可降低飼料消耗，加快體蛋白質(zhì)的沉積，促進(jìn)生長(zhǎng)，同時(shí)還可維持機(jī)體的免疫水平。血清ALB含量升高，說(shuō)明維生素D能加強(qiáng)肝、腎功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收和代謝，提高機(jī)體免疫功能。王麗等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加維生素D3能顯著提高籠養(yǎng)育成蛋鴨血清TP及ALB含量，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。解新霞［7］研究表明，飼糧維生素 D添加水平為5 000 IU/kg時(shí)，肉雞免疫功能較強(qiáng)。IL-2是T細(xì)胞和自然殺傷性細(xì)胞(NK細(xì)胞)產(chǎn)生的糖蛋白，夠刺激NK細(xì)胞的生長(zhǎng)和增強(qiáng)其殺傷功能，并激發(fā)B細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體產(chǎn)生［8］，增強(qiáng)機(jī)體抗感染和抗應(yīng)激的能力。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧維生素D添加水平對(duì)血清IL-2含量有顯著影響，隨飼糧維生素D添加水平的升高，血清IL-2含量有下降趨勢(shì)。有關(guān)報(bào)道表明，維生素D可以抑制T細(xì)胞分泌IL-2［9］，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。這說(shuō)明維生素D對(duì)蛋雛鴨免疫系統(tǒng)有一定的調(diào)節(jié)作用。

3.3 飼糧維生素D添加水平對(duì)蛋雛鴨抗氧化功能的影響

抗氧化酶能夠清除自由基，抵御氧化損傷。SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)最主要的抗氧化酶，其協(xié)同完成細(xì)胞內(nèi)的抗氧化作用。SOD作用于超氧陰離子(O2－)，使其轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫(H2O2)和其他氫過(guò)氧化物，從而阻止O2－啟動(dòng)的自由基連鎖反應(yīng)。GSH-Px可以幫助清除H2O2和許多有機(jī)氫過(guò)氧化物的酶，它能催化H2O2和還原脂質(zhì)過(guò)氧化物，防止脂質(zhì)過(guò)氧化物對(duì)機(jī)體生物膜和組織的損傷，并防止脂質(zhì)過(guò)氧化物進(jìn)一步水解為有害物質(zhì)丙二醛，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，維生素D對(duì)SOD和GSH-Px活性有較強(qiáng)的誘導(dǎo)能力，從而維持了動(dòng)物體自身自由基的產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡。楊徳智［10］研究得出25－羥基維生素D3(25-OH-D3)、維生素D3和植酸酶的協(xié)同作用對(duì)SOD的活性有重要意義。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨飼糧維生素D添加水平升高，血清和肝臟SOD和GSH-Px活性呈先升高后下降趨勢(shì)，表明飼糧適量添加維生素D可提高蛋雛鴨機(jī)體SOD和GSH-Px活性，增強(qiáng)其抗氧化功能。

T-AOC的大小可反映機(jī)體自由基代謝的狀態(tài)，測(cè)定T-AOC對(duì)機(jī)體酶和非酶系統(tǒng)抗氧化能力綜合評(píng)判具有重要意義［11］。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈?zhǔn)浇K止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物，其含量可以間接反映自由基的產(chǎn)生情況和機(jī)體組織細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度［12］。機(jī)體中 T-AOC和MDA的含量作為判斷機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激程度，較為敏感、準(zhǔn)確及方法可操作性強(qiáng)［13］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨飼糧維生素D添加水平的升高，血清和肝臟T-AOC升高，MDA含量降低。經(jīng)過(guò)回歸分析，添加523.0、550.0 IU/kg的維生素 D時(shí)可分別使血清和肝臟T-AOC活性最高，添加522.7 IU/kg的維生素D時(shí)血清MDA含量最低。張淑云等［14］研究同樣發(fā)現(xiàn)，隨飼糧維生素D添加水平的升高，血清和肝臟總超氧化物歧化酶(T-SOD)、GSH-Px活性以及T-AOC升高，MDA含量降低。由此可見(jiàn)，飼糧中適量添加維生素D對(duì)蛋雛鴨抗氧化功能具有一定的促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

①玉米－豆粕型基礎(chǔ)飼糧中適量添加維生素D能夠提高1～28日齡蛋雛鴨機(jī)體的免疫及抗氧化功能。

②綜合考慮各指標(biāo)，通過(guò)二次回歸模型估測(cè)得出維生素D適宜添加量為512.8～550.0 IU/kg。

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