劉 千 陳 黎 胡用軍 葉鳳琴 陳 強

麥胚谷胱甘肽提取與含量測定方法研究

劉 千1陳 黎2胡用軍2葉鳳琴2陳 強3

(四川農業(yè)大學農學院1，溫江 611130)
(宜賓市產品質量監(jiān)督檢驗所2，宜賓 644002)
(四川農業(yè)大學食品學院3，雅安 625014)

旨在建立用反相高效液相色譜(RP－HPLC)法同時檢測小麥胚中谷胱甘肽(glutathione)還原型(G－SH)和氧化型(G－S－S－G)含量的方法。為了更高效地提取谷胱甘肽，在水作溶劑條件下，考察了不同浸泡時間、超聲時間、料液比、超聲溫度、溶劑pH和沉淀劑比例對谷胱甘肽提取效率的影響。并在2種色譜柱上，考察了5種流動相下谷胱甘肽含量測定結果。最終確定最適提取條件為:提取溶劑pH 4．0，料液比1∶30，浸泡1 h后在0℃下超聲10 min，沉淀劑比例為1∶2．0;色譜條件為:Fusion－RP柱(150×4．6 mm，4μm，8 nm);流動相:水(0．08%辛烷磺酸鈉+0．24%磷酸二氫鈉，以磷酸調pH 2．5)－乙腈(體積比為82∶8);檢測波長為210 nm;流速為1．0 mL·min－1;柱溫為25℃。測定了19份不同來源麥胚中谷胱甘肽的含量，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽含量差異顯著，最高達180．71 mg·(100 g)－1。

麥胚 谷胱甘肽 提取 含量

谷胱甘肽(glutathione)是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)經肽鍵縮合而成的活性三肽，有還原型(G－SH)和氧化型(G－S－S－G)2種形態(tài)，在生理條件下以還原型占絕大多數(shù)。國外早在20世紀二三十年代就開始了對其生理功能的研究［1］。它能保護生物膜、抗衰老、解毒、抗癌、預防動脈硬化及抑制飲酒過度而引起的脂肪肝，也是細胞內主要還原型物質，能保護細胞免受氧化及有毒物質的損傷［2］。隨著對谷胱甘肽研究的深入，其在食品［3－4］、醫(yī)學［2］、保?。?－6］、抗衰老［7］等方面的應用正日益引起人們的廣泛關注。谷胱甘肽作為功能活性因子，是制作功能性食品的理想添加劑［3］。

目前，食品工業(yè)中已廣泛使用抗氧化劑，但絕大多數(shù)屬人工合成，隨著人們越來越關心食品安全問題，天然谷胱甘肽的強抗氧化活性和高安全性，在保健食品等領域將有極好的應用前景［8］。而谷胱甘肽在自然界含量豐富，尤其在小麥胚中含量最多，高達0．47%［9］。當前，對麥胚營養(yǎng)價值、功能特性和麥胚穩(wěn)定化技術以及麥胚應用的研究較多，但關于麥胚中谷胱甘肽含量測定方法研究較少，僅見曹新志等［10］采用熒光法進行。麥胚中谷胱甘肽的提取方法有劉國琴等［11］用浸提法，周惠明等［12］用離子交換分離法，盧敏等［13］用高壓電脈沖法，尚未見用超聲提取法。

目前，常見的測定其他植物或食品中谷胱甘肽含量包括紫外分光光度法、酶法、熒光光度法、電化學法和高效液相色譜法等［5－6，14－16］。其中，高效液相色譜法因具有靈敏性高，專一性強，線性范圍寬，穩(wěn)定性較高等特點應用范圍越來越廣。

本研究比較了不同浸泡時間、超聲時間、料液比、超聲溫度、溶劑pH和沉淀劑比例對谷胱甘肽提取效率的影響，力求更高效地從小麥胚中提取谷胱甘肽，并建立同時測定小麥胚中GSH和GSSG含量的HPLC法，為麥胚功能性食品方面的開發(fā)和麥胚中谷胱甘肽的提取、測定提供一定科學依據。

1 材料與方法

1．1 供試材料

19份不同來源小麥生/熟胚為供試樣品，樣品編號及來源見表1。樣品粉碎過40目篩后烘干保存?zhèn)溆谩＿x取1號材料進行提取條件和色譜條件試驗。

表1 供試材料19份小麥胚的來源

1．2 儀器與試劑

KQ－100B超聲波清洗機:昆山超聲波儀器公司;UV－265型紫外－可見分光光度儀、高效液相色譜儀［SPD－10A VP紫外－可見檢測器、LC－6A高壓泵、CTO－10AS VP柱溫箱(含7725i型手動進樣器)，浙大智達N2000工作站］:Shimadzu公司;CP225D型電子天平:Sartorius公司;Milli－Q型純水儀:Millipore公司。

GSH和GSSG對照品:Sigma公司;辛烷磺酸鈉:上海藍季科技發(fā)展有限公司;色譜純乙腈、分析純磷酸二氫鈉、氯仿等其余試劑:成都市科龍化工試劑廠。

1．3 供試品溶液的制備

按表2中的試驗設計順序逐一進行單因素試驗?？疾旖輹r間時，其他因素取中間變量值;最佳浸泡時間確定后，采用確定的條件考察超聲時間，未考察因素則取中間變量值;以此類推，各設3次重復。精密稱取1 g麥胚粉于100 mL具塞三角瓶中，加入蒸餾水并小幅度振蕩均勻，稱定三角瓶和溶液的總質量，在暗室中放置一定時間后取出。將樣液放在特定溫度的水中用超聲波提取樣品一定時間之后，擦凈外壁再次稱量并按先前稱定的總質量補加提取溶劑。吸取溶液0．5 mL至1．5 mL離心管中，按比例加入沉淀劑氯仿，于10 000 r/min下離心15 min。吸取上清液10μL進行HPLC測定。

表2 各單因素和其變量值

1．4 對照品溶液的制備

精密稱取GSH、GSSG對照品，配制濃度分別為7．72μg/mL與8．64μg/mL、15．44μg/mL與17．28 μg/mL和30．88μg/mL與34．56μg/mL的GSH∶GSSG對照品混合溶液。

1．5 色譜條件和系統(tǒng)適用性實驗

分別在色譜柱:Synergi 4μHydro－RP 8 nm，150×4．6 mm和Synergi 4μFusion－RP 8 nm，150×4．6 mm上考查了5種流動相對GSH和GSSG分離的影響。其中流動相Ⅰ(水－乙腈)考察比例為:99∶1，98∶2，97∶3;流動相Ⅱ(辛烷磺酸鈉+磷酸二氫鈉混合溶液－乙腈)考察比例為:92∶8，93∶7，94∶8，95∶5，90∶10，Ⅰ和Ⅱ均用磷酸調節(jié)pH為2．5、3．0和3．5。綜合考慮分離度、理論塔板數(shù)和分析時間，選擇色譜柱:Synergi 4μFusion－RP 8 nm，150×4．6 mm;流速為1．0 mL·min－1;柱溫25℃;進樣量為10μL;流動相:水(0．08%辛烷磺酸鈉+0．24%磷酸二氫鈉，以磷酸調pH 2．5)－乙腈(體積比為82∶8);檢測波長為210 nm的色譜條件。此色譜條件下，理論塔板數(shù)以GSH和GSSG的峰計算均不低于4 000，如圖1所示。

圖1 對照品色譜圖

2 結果與討論

2．1 谷胱甘肽提取條件選擇

谷胱甘肽的超聲波提取條件單因素試驗結果見圖2。

圖2 超聲波提取條件的單因素試驗結果

各數(shù)據均為3次重復的平均值，經顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)浸泡時間、超聲時間、物料比和提取溫度各變量間差異達到極顯著，溶劑pH差異不顯著，沉淀劑比例差異顯著。單因素試驗的最佳條件為:浸泡時間1 h、超聲時間10 min、物料比1∶30、提取溫度0℃、沉淀劑比例1∶2．0;考慮到用提取溶劑溶解樣品時，溶劑pH對谷胱甘肽含量影響不大，由于小麥胚芽蛋白的等電點為pH 4．0，利于后面蛋白質的除雜，所以采用4．0作為最佳pH值。

劉國琴等［11］曾報道85℃浸提GSH得率最高。但本研究之前按其方法在60～90℃每間隔10℃提取，并用碘量法測定，發(fā)現(xiàn)此條件下，GSH峰與雜質峰重合使測定的GSH峰面積偏高很多。經重新建立色譜條件將兩峰分離后發(fā)現(xiàn)，增加溫度僅使雜質峰增大，而GSH峰面積基本不變。故在此溫度段，增加超聲溫度對提高GSH的提取無顯著效果，考慮到浸提與超聲提取的差異，后續(xù)試驗中只考察了0、25和50℃。物料比的選擇上，劉國琴等［11］和盧敏等［13］分別采用了1∶9和1∶20的物料比，陳麗娜等［14］提取玉米胚中谷胱甘肽用的物料比是1∶10，而本試驗中的最佳物料比為1∶30。這可能是由于劉國琴等［14］采用的是攪拌浸提，盧敏等［13］采用高壓電脈沖，而陳麗娜等［14］則是對玉米胚進行先超聲(時間5 s/次，超聲次數(shù)30次，間隔時間5 s)后振蕩的提取，提取方法和原料不同導致差異。針對浸泡時間因素，還進行了4、8、12 h的試驗，超聲時間進行了40 min和50 min的試驗，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽含量都較低，因此后續(xù)試驗未進一步考察。

2．2 色譜條件方法學考察

2．2．1 線性關系

取GSH、GSSG濃度分別為7．72、8．64μg/mL的對照品混合溶液，進樣1、5、10、15、20μL，濃度分別為15．44、17．28μg/mL的對照品混合溶液，進樣12．5、15、17．5、20μL，再取濃度分別為30．88、34．56μg/mL的對照品混合溶液，進樣12．5、15、17．5、20μL，按“1．5”所述色譜條件測定。分別以GSH和GSSG峰面積為縱坐標，GSH和GSSG進樣量(μg)為橫坐標，分別繪制標準曲線，計算得到回歸方程如下:

GSH的回歸方程為:Y=620 490X+742

R=0．999 8

GSSG的回歸方程為:Y=777 678X+110 8

R=0．999 5

以上結果表明GSH和GSSG在0．007 7～0．617 6 μg和0．008 6～0．691 2μg范圍內具有良好的線性關系。

2．2．2 精密度

精密吸取GSH和GSSG的對照品混合溶液5μL，重復進樣6次。得到GSH峰面積分別為:261 385、265 444、261 942、266 128、261 042和265 159，RSD為0．87%;GSSG峰面積分別為:332 281、333 540、332 286、327 274、326 7337和333 765，RSD為0．95%。表明進樣精密度良好。

2．2．3 穩(wěn)定性

據有關文獻表明［4］，GSH水溶液在空氣中易被氧化，可加入具有強還原性的物質如維生素C等保護其不被氧化。因此本次試驗通過對對照品加VC和不加VC考察了其穩(wěn)定性。分別吸取不加VC的GSH和GSSG的對照品混合溶液5μL，連續(xù)6 d內每天進樣1次測定，結果混合標樣中GSH和GSSG峰面積RSD分別為2．25%和2．58%;再分別吸取加VC的GSH和GSSG的對照品混合溶液5μL，連續(xù)6天內每天進樣1次測定，結果混合標樣中GSH和GSSG峰面積RSD分別為3．03%和0．26%?？梢钥闯?，加VC和不加VC對對照品溶液的穩(wěn)定性在6 d內沒影響，且具有良好的穩(wěn)定性。因此，選用不加VC的對照品溶液。

2．2．4 重復性

稱取供試品6份，按“1．3”制備，測得GSH含量分別為35．01、34．35、34．40、33．49、32．62和32．45 mg/100 g，平均含量為(33．72±1．03)mg/100 g，RSD為3．08%;該供試樣品中未檢出GSSG。

2．2．5 加樣回收率

精密稱取1 g樣品，加入GSH和GSSG標樣并按“1．3”制備后測定。GSH與GSSG各自的加入量、回收率和相對標準偏差列于表3。由表3可知，GSH在3個不同加入量下的回收率分別為94．80%、102．00%和96．09%，平均回收率為97．63%，RSD為3．93%;GSSG在3個不同加入量下的回收率平均值則分別為94．25%、102．10%和94．56%，平均回收率為96．97%，RSD為4．59%。結果表明GSH和GSSG的回收良好。

表3 GSH和GSSG的回收率

2．3 19份麥胚樣品的測定

不同來源的19份小麥胚樣品中谷胱甘肽含量測定結果見表4。

表4 19份小麥胚中谷胱甘肽含量/mg·(100 g)－1

測定條件:提取溶劑pH 4．0，料液比1∶30，浸泡時間1 h，在0℃下超聲10 min，沉淀劑比例為1∶2．0;色譜條件為:Fusion－RP柱(150×4．6 mm，4μm，8 nm);流動相:水(0．08%辛烷磺酸鈉+0．24%磷酸二氫鈉，以磷酸調pH 2．5)－乙腈(體積比為82∶8);檢測波長為210 nm;流速為1．0 mL·min－1;柱溫為25℃?？梢钥闯龉入赘孰暮糠秶?．58～180．71 mg·(100 g)－1;其中GSH和GSSG含量范圍分別在ND(未檢出)～105．46 mg·(100 g)－1和ND(未檢出)～97．21 mg·(100 g)－1。據報道，小麥胚芽中谷胱甘肽含量為98～107 mg·(100 g)－1［15－16］。本研究的含量范圍變幅較大，可能與材料來源有關，與生熟加工方式無必然聯(lián)系。

3 結論

通過以上試驗可以看出，在最適提取條件下，用Fusion－RP柱(150×4．6 mm，4μm，8 nm)，流動相:水(0．08%辛烷磺酸鈉+0．24%磷酸二氫鈉，以磷酸調pH 2．5)－乙腈(體積比為82∶8)，檢測波長為210 nm，流速為1．0 mL·min－1，柱溫為25℃，同時測定小麥胚中GSH和GSSG，分別在0．007 7～0．617 6μg和0．008 6～0．691 2μg范圍內具有良好的線性關系;進樣精密度良好，重復性和穩(wěn)定性高，回收良好;檢測的19份不同來源麥胚樣品谷胱甘肽含量差異較大。因此，此法可為麥胚中谷胱甘肽的開發(fā)利用提供一定參考依據。

［1］Markianova L M，Dorikovich A N，Gomyak T M，et．al．Effect of wheat Germ on Quality and Aroma of sweet Biscuits［J］．Khlebopek Konditer Prom，1984，10:37－39

［2］席秀芳，趙秀川．谷胱甘肽的藥理與臨床［J］．中國醫(yī)學文摘:內科學，2004，25(1):125－127

［3］蔡?。入赘孰牡难芯窟M展［J］．糧食與飼料工業(yè)，2000(10):41－42

［4］劉超，袁建國，李峰．谷胱甘肽國內外研究進展［J］．山東食品發(fā)酵，2010，4:7－10

［5］翟文慧，王愛月．紫外分光光度法測定保健食品中谷胱甘肽［J］．預防醫(yī)學論壇，2005，11(5):560－561

［6］王愛月，解魁，李發(fā)生．高效液相色譜法測定保健食品中谷胱甘肽含量的方法研究［J］．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17(7):1181－1182

［7］曹新志．富含谷胱甘肽制品對小白鼠抗衰老能力的影響［J］．四川食品工業(yè)科技，1996，15(4):22－24

［8］曹平．天然抗氧化肽研究進展［J］．糧食與油脂，2004，10:8－11

［9］韓文鳳，邱潑．小麥胚芽的開發(fā)利用研究動態(tài)［J］．糧食加工，2008，33(3):64－67

［10］曹新志，陳彥．熒光法測定小麥胚中的谷胱甘肽［J］．糧食與飼料工業(yè)，2001(11):46－47

［11］劉國琴，陳潔，趙雷，等．小麥胚芽中谷胱甘肽提取方法探討及工藝條件優(yōu)化［J］．河南工業(yè)大學學報:自然科學版，2007，28(2):1－5

［12］周惠明，朱科學．小麥胚中谷胱甘肽的純化與富集的研究［J］．中國糧油學報，2003，18(1):17－20

［13］盧敏，殷涌光，劉喻．高壓電脈沖提取小麥胚谷胱苷肽的影響因素研究［J］．食品科學，2005，26(8):205－207

［14］陳麗娜，石矛，王大為．玉米胚谷胱甘肽提取及純化技術的研究［J］．食品科學，2009，34(2):160－166

［15］劉宜峰，曹新志．新型食品添加劑——谷胱甘肽［J］．福州大學學報，2002，30:714－721

［16］袁爾東，鄭建仙．功能性食品基料——谷胱甘肽的研究進展［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，25(5):52－57．

Study on Extraction and Determination Method of Glutathione from Wheat Germ

Liu Qian1Chen Li2Hu Yongjun2Ye Fengqin2Chen Qiang3
(College of Agronomy，Sichuan Agricultural University1，Wenjiang 611130)
(Yibin City Product Quality Supervision and Inspection Institute2，Yibin 644002)
(College of Food Science，Sichuan Agricultural University3，Ya'an 625014)

This study is to establish the RP－HPLC method to determine the content of GSH and GSSG simultaneously．Using distilled water as solvent，the effect of the time of soak，time of ultrasonic extraction，material liquid ratio，temperature of ultrasonic extraction，solvent pH，and precipitating agent proportion on the the extracted efficiency of Glutathione were determined．The contents of glutathione were determined by using 2 chromatogram columniations and 5 mobile phases．Finally，the optimal conditions were determined．The solvent pH was 4．0，the material liquid ratio was 1∶30，the time of soak was 1 h，ultrasonic extraction 10 min in 0℃ ，and precipitating agent proportion was 1∶2．0．Chromatogram conditions were Fusion－RP column(4．60×150 mm，4μm，8 nm)at 25℃ ，the mobile phase were both a mixture of 0．08%octanesulfonic acid sodium salt and 0．24%Sodium dihydrogen phosphate in water and acetonitrile(82∶8，V/V)，adjusted to pH 2．5 with phosphoric acid．The UV detection wavelength was set at 210 nm．The flow rate was 1．0 mL·min－1．The glutathione contents from 19 wheat germs were determined．The glutathione contents had significant difference．The maximal content was 180．71 mg·(100 g)－1．

wheat germ，glutathione，extract，content

S－3

A

1003－0174(2012)10－0104－06

四川農業(yè)大學雙支計劃博士專項(06070401)

2012－02－02

劉千，女，1981年出生，實驗師，作物遺傳育種

陳黎，男，1979年出生，副教授，生物化學與分子生物學