張秀華，陳云書(shū)，侯小華，李桂芹

深靜脈血栓形成 (deep vein thrombosis，DVT)和其嚴(yán)重并發(fā)癥肺血栓栓塞癥 (PTE)合稱為靜脈血栓栓塞癥 (VTE)，是醫(yī)院內(nèi)常見(jiàn)、高發(fā)病，具備高死亡率及可預(yù)防的特點(diǎn)。VTE目前已經(jīng)成為第3位最常見(jiàn)的血管類(lèi)疾病，其發(fā)生率與腦卒中相當(dāng)。DVT的發(fā)生與遺傳因素相關(guān)，而遺傳因素占DVT發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素的60%［1］。其中，凝血與纖溶系統(tǒng)的基因多態(tài)性是當(dāng)前深靜脈血栓形成病因?qū)W研究的熱點(diǎn)。本研究以纖維蛋白原基因及PAI基因作為候選基因，選擇多態(tài)性位點(diǎn)，探索凝血與纖溶系統(tǒng)基因多態(tài)性與DVT形成之間的關(guān)系，分析多位點(diǎn)的聯(lián)合作用對(duì)于DVT發(fā)生的影響，從而為國(guó)人DVT的病因?qū)W研究及預(yù)防、診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 DVT組:2006年1月—2010年10月就診于河北省遷安市人民醫(yī)院呼吸科及普外科的漢族DVT患者共132例，其中男73例，女59例;年齡46～75歲，平均 (63.36±11.77)歲。所有患者經(jīng)臨床查體和下肢靜脈超聲證實(shí)存在下肢深靜脈血栓。對(duì)照組:同期于河北省遷安市人民醫(yī)院體檢中心的健康體檢者155名，其中男87例，女68例;年齡45～78歲，平均 (64.23±12.01)歲。對(duì)照組患者均除外心血管疾病、腦血管疾病、高血壓病、糖尿病、外周動(dòng)靜脈疾病及惡性腫瘤。DVT組與對(duì)照組基線臨床資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見(jiàn)表1)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及保存 所有研究對(duì)象抽取外周靜脈血3～5ml，EDTA抗凝，采用酚－氯仿法抽提DNA。保存于－20℃冰箱。

1.2.2 候選基因及研究位點(diǎn)的選擇 根據(jù)國(guó)際上關(guān)于凝血與纖溶基因研究的熱點(diǎn)，選取纖維蛋白原基因β455G/A、PAI基因4G/5G多態(tài)性作為候選研究位點(diǎn)進(jìn)行分析。

1.2.3 上游引物 Fgβ455G/A:5'－AGAATAGGGTATGAATTTGTTATT－3';下游引物:5'－AATCGTGACTCATTAATGATACCA－3'。PAI基因4G/5G:上游引物:5'－CAGCACACCTCCAACCTCAG－3';下游引物:5'－CCCAACAGAGGACTCTTGGTC－3'。在基因文庫(kù) (Genebank)中核對(duì)病尋找相應(yīng)的序列。PCR反應(yīng)體系為 25μL:STR緩沖液 (包含MgCl2，dNTP，10×緩沖液)2.5μL，上下游引物各2μL，Taq酶0.3μL，模板 DNA1.5μL，ddH2O補(bǔ)充至25μL。PCR 擴(kuò)增條件:Fgβ455G/A:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸60s，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7min;PAI基因4G/5G:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火60s，72℃延伸60s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增采用PE2400型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行。在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中，在80～100V的電壓下，0.5%TBE電泳緩沖液中恒壓電泳60min(北京六一儀器廠)在透射紫外線平臺(tái)下觀察DNA擴(kuò)增條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有資料采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組間纖維蛋白原基因β455G/A基因型及等位基因頻率分布比較纖維蛋白原基因β455G/A多態(tài)性AA基因型在DVT組分布頻率為7.6%，在對(duì)照組為11.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。A等位基因在DVT組分布頻率為32.6%，在對(duì)照組為24.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見(jiàn)表2)。

2.2 兩組間PAI基因4G/5G多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布比較 PAI基因4G/5G多態(tài)性4G/4G基因型在DVT組分布頻率為50.8%，在對(duì)照組為34.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。4G等位基因在DVT組分布頻率為71.2%，在對(duì)照組為59.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見(jiàn)表3)。

2.3 DVT患病的多因素分析 以DVT患病作為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示年齡、糖尿病史及AA+4G/4G聯(lián)合基因型為DVT患病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 (P＜0.05)。其中AA+4G/4G聯(lián)合基因型使DVT患病風(fēng)險(xiǎn)增加136.4% (P＜0.01，見(jiàn)表4)。

表1 研究對(duì)象臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data of object

表2 兩組間纖維蛋白原基因β455G/A基因型及等位基因頻率分布比較Table 2 Comparison of beta gene 455G/A genotype and allele frequency distribution between two groups

表3 兩組間PAI基因4G/5G多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布比較Table 3 Comparison of the PAI gene 4G/5G polymorphism genotype and allele frequency distribution between two groups

表4 DVT危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析Table 4 Logistic regression analysis of DVT risk factors

3 討論

纖維蛋白原 (fibrinogen，F(xiàn)g)是重要的凝血因子，在凝血、血小板聚集、纖溶調(diào)節(jié)、動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展等諸多方面起著重要的作用。近年來(lái)，已見(jiàn)報(bào)道10多個(gè)Fgβ基因多態(tài)性位點(diǎn)，但這些基因多態(tài)性是否對(duì)血漿纖維蛋白原水平及血栓性疾病是否有影響卻存在爭(zhēng)議。流行病學(xué)資料表明，－455GG純合子與－455GA型雜合子及－455AA型純合子相比，GG型個(gè)體的血漿Fg水平最低，GA型次之，AA型最高［2］。多項(xiàng)研究表明，F(xiàn)bβ455G/A 多態(tài)性與血栓性疾病的患病相關(guān)［3－5］。在本研究中:FGβ448G/A 3種基因型在DVT組與對(duì)照組中的分布頻率不同，448AA+AG型在DVT組的分布頻率高;等位基因在DVT組與對(duì)照組中的分布頻率也不同，A－448等位基因在DVT組的分布頻率高，提示攜帶A等位基因的人群患DVT的風(fēng)險(xiǎn)增加。而原因可能與攜帶A等位基因的人群平均Fg水平較高有關(guān)。

纖溶功能下降是多種血栓性疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一，纖溶酶原激活劑抑制物 (plasminogen activator inhibitor，PAI)約占纖溶系統(tǒng)抑制物活性的60%，PAI－1是其中最重要的成分。PAI－1基因啟動(dòng)子區(qū)存在4G/5G多態(tài)性。PAI－1基因4G/5G多態(tài)性對(duì)調(diào)節(jié)PAI－1基因的表達(dá)有重要作用。4G/5G插入/缺失多態(tài)性影響與核蛋白的結(jié)合并參與調(diào)節(jié)PAI－l的基因轉(zhuǎn)錄，伴隨發(fā)生與4G/5G基因型相關(guān)的PAI－1合成速率增加并且增加心肌梗死及腦梗死的患?。?－8］。在本研究中，4G/4G基因型及4G等位基因的頻率分布在DVT組要顯著高于對(duì)照組，提示該基因可能通過(guò)影響體內(nèi)纖溶活性及纖維蛋白原的水平從而影響DVT的發(fā)病。

國(guó)內(nèi)外研究多局限于對(duì)這兩個(gè)基因多態(tài)性分別進(jìn)行分析，而本研究還將兩個(gè)凝血與纖溶系統(tǒng)的聯(lián)合基因型進(jìn)行了多因素分析。在排除了混雜因素的影響后，AA+4G/4G聯(lián)合基因型人群患DVT的風(fēng)險(xiǎn)較其他基因型人群增加了136.4%，提示該基因型為DVT患病較強(qiáng)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。這將為今后臨床篩查、預(yù)防與治療DVT提供重要參考。針對(duì)不同的基因型采取合理干預(yù)措施，從而減少DVT的發(fā)病。同時(shí)，本研究還存在樣本量不足等局限，由于AA+4G/5G聯(lián)合基因型在人群中構(gòu)成比例偏低，因此，尚需進(jìn)行更大規(guī)模的人群的驗(yàn)證性研究。

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