趙燕穎，李亞剛，楊澤成，張舵舵，趙春燕

（1.吉林大學(xué)第四臨床醫(yī)院 內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130011；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 普外科，吉林 長(zhǎng)春130033；3.吉林大學(xué) 白求恩醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021）

siRNA抑制人肝癌細(xì)胞MDM2表達(dá)及細(xì)胞增殖的研究

趙燕穎1，3，李亞剛1，楊澤成2，張舵舵2，趙春燕3＊

（1.吉林大學(xué)第四臨床醫(yī)院 內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130011；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 普外科，吉林 長(zhǎng)春130033；3.吉林大學(xué) 白求恩醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021）

目的 探討siRNA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞MDM2基因表達(dá)的抑制作用及對(duì)增殖的影響。方法體外合成針對(duì)MDM2基因的siRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞株；應(yīng)用RT-PCR和western blot方法檢測(cè)siRNA對(duì)MDM2和P53基因和蛋白表達(dá)的影響，并用MTT法檢測(cè)siRNA對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果和空白組比轉(zhuǎn)染siMDM2-1，2的HepG2細(xì)胞的MDM2基因和蛋白表達(dá)減低，而P53基因和蛋白表達(dá)增加。陰性對(duì)照質(zhì)粒組的基因表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。轉(zhuǎn)染siRNA MDM2后細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，轉(zhuǎn)染siMDM2-1，2和陰性對(duì)照質(zhì)粒后的抑制率分別是46.3%、56.1%和3%。和對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染siMDM2-1，2的hepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，而轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的hepG細(xì)胞周期未發(fā)生明顯變化。結(jié)論siRNA MDM2可以有效抑制HepG2細(xì)胞株中MDM2的表達(dá)，促進(jìn)P53的表達(dá)，同時(shí)可以使細(xì)胞周期發(fā)生變化，這可能是其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的主要機(jī)制之一。

肝細(xì)胞癌；MDM2；si RNA；凋亡

（ChinJLabDiagn，2012，16：1790）

肝癌的發(fā)生涉及多種致病原因和危險(xiǎn)因素。目前，原癌基因、抑癌基因、凋亡基因等癌癥相關(guān)基因的過(guò)度表達(dá)被認(rèn)為是肝癌發(fā)生的主要原因［1］。MDM2是p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的下游基因，作為p53的重要調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等過(guò)程。MDM2作為原癌基因具有泛素化－蛋白酶降解抑癌基因p53的功能，從而抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞增殖［2，3］。本研究中，我們構(gòu)建了針對(duì)人MDM2特異性發(fā)卡狀siRNA （small interfering RNA）質(zhì)粒表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞，進(jìn)一步研究其沉默MDM2對(duì)其增殖的影響和初步探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基 （GBICO）；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒（Invitrogen）、SilencerTM siRNA construction kit（Ambion公司）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司）；引物由上海生工生物技術(shù)公司合成；細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所）。

1.2 siRNA的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)已知Genebank MDM2mRNA序列和siRNA的設(shè)計(jì)原則［4］，利用Ambion公司的在線(xiàn)設(shè)計(jì)來(lái)尋找靶序列，并做同源序列搜索，排除那些和其他編碼序列或EST同源的序列。用silencerTM siRNA construction kit體外合成 si-MDM2 1，si-MDM2 2，陰性對(duì)照（control siRNA）購(gòu)于Ambion，與任何編碼序列無(wú)同源性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞于IMDM培養(yǎng)液 （含10% 新生牛血清，青霉素100μg／ml，鏈霉素100μg／ml）中，37℃5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，常規(guī)更換生長(zhǎng)液、消化傳代，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，傳代于孔板或培養(yǎng)瓶，在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，細(xì)胞融合率達(dá)80%－95%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。操作按LipofectamineTM 2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)轉(zhuǎn)染后72h收集各組siRNA MDM2和control siRNA細(xì)胞，按Trizol操作說(shuō)明，分別提取總RNA，紫外分光光度計(jì)定量。RNA樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RT-PCR所有操作均按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以βactin做為內(nèi)參，MDM2擴(kuò)增產(chǎn)物為300bp，上游引物5’-AACCACCTCACAGATTCCAG-3’，下游引物5’-TCAAGGTGACACCTGTTCTC-3’；P53擴(kuò)增引物為490bp，上游引物5＇-GTGGTGGTGCCCTATGAG-3＇；下 游 引 物 5＇-GGGAGGTAGACTGACCCTTT-3＇；β-actin 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物為520bp，上游引物：5’2GGGACCTGACAGACTACCT23’下游引物：5’2CGTACTCCTGCTTGCTGA23’。擴(kuò)增條件：94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠系統(tǒng)電泳（含溴化乙啶），拍照鑒定。用 Pharmacia ImageMaster凝膠成像儀觀察，并用ImageMaster軟件分析條帶峰面積，轉(zhuǎn)染各組信號(hào)值相對(duì)于對(duì)照組的百分率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72h，用PBS清洗后加預(yù)冷的裂解液，收集細(xì)胞，輕微超聲粉碎細(xì)胞10s，測(cè)蛋白質(zhì)濃度，取50μg蛋白上樣，12%SDS PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。含有樣品的硝酸纖維素膜用10g／L脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜后用配制的TBST洗，用按1∶200稀釋的兔抗人MDM2、wtP53和βactin單克隆抗體37℃振蕩反應(yīng)2h，用TBST洗。然后用按1∶1 000稀釋的山羊抗兔二抗37℃反應(yīng)1h，TBST洗，DAB法顯色。用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶灰度值，來(lái)反映蛋白的表達(dá)變化。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞以5×103／孔接種于96孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染2組siRNA MDM2和control siRNA使其終濃度達(dá)50nmol／L，未處理組加入相應(yīng)體積的PBS，轉(zhuǎn)染24，48，72h后，每孔加入15μl MTT（5mg／ml）培養(yǎng)4h，再加入150μl／孔的DMSO，振蕩10min，用酶標(biāo)儀570nm處測(cè)定吸光度（A）值。根據(jù)公式：細(xì)胞增殖抑制率（%）＝ （1－處理組吸光度／未處理組吸光度）×100%，計(jì)算出抑制率。每組均設(shè)3個(gè)平行孔（取平均值作為1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果），并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期按1×106／瓶將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，分別轉(zhuǎn)染2組的siRNA MDM2和control siRNA。培養(yǎng)72h，用消化法收集細(xì)胞，用冷PBS充分洗滌，制備成單細(xì)胞懸液，用70%乙醇處理過(guò)夜，碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。每組均設(shè)3復(fù)管，并重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用成組t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒酶切和測(cè)序鑒定PGCsilencerTMMDM2siRNA經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后呈2條帶，分成大的載體片段和小的目的片段，見(jiàn)圖1。將重組質(zhì)粒PGCsilencerTM-MDM2-siRNA送上海生 工 測(cè) 序 （測(cè) 序 號(hào) D02.CS060503093＿0253.SD13D229-1.F；D04.CS060503093 ＿0255.SD13D230-1.F），引物序列根據(jù)載體序列，采用 Primer-Premier5.0設(shè)計(jì)為：5′-AAGAAGAGAGTGTGGAATCTA-3′。結(jié)果表明siRNA表達(dá)模板成功構(gòu)建于PGCsilencer載體上，序列完全正確，與目的序列相同。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.2 siMDM2轉(zhuǎn)染后對(duì)hepG2細(xì)胞MDM2和P53基因表達(dá)的影響半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示MDM2，P53和β-actin引物的擴(kuò)增基因片段經(jīng)電泳和EB染色后，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小與所設(shè)計(jì)的大小完全一致。和轉(zhuǎn)染control siRNA及空白組的hepG2細(xì)胞比較轉(zhuǎn)染si2MDM2-1、si2MDM2-2的hepG2細(xì)胞中MDM2mRNA的表達(dá)水平顯著減低，而P53mRNA表達(dá)水平明顯增加（如圖2）。而和空白組比較control siRNA組各基因表達(dá)水平無(wú)明顯改變。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染si-MDM2-1、si-MDM2-2和control siRNA 的hepG2中 MDM2－mRNA的表達(dá)量分別下降至空白組的39.06%，32.61%和94.8%，si-MDM2組和空白組比轉(zhuǎn)染差異有顯著性，P＜0.05；control siRNA與空白組比無(wú)明顯差異，P＞0.05。和空白組比較轉(zhuǎn)染si MDM2組P53mRNA表達(dá)水平分別上調(diào)46.2%和52.1%左右（P＜0.05）；control siRNA 組無(wú)明顯改變，P＞0.05。

2.3 siMDM2轉(zhuǎn)染后對(duì)hepG2細(xì)胞MDM2和P53蛋白因表達(dá)的影響western blot結(jié)果顯示hepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組β-actin蛋白表達(dá)量基本相同，陰性對(duì)照組和空白組的各目的蛋白表達(dá)量相似，siRNA MDM2-1和siRNA MDM2-2組的各目的蛋白表達(dá)量相似，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。和對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染2組siRNA MDM2的MDM2蛋白表達(dá)量有不同程度的下調(diào)，P53蛋白表達(dá)水平有不同程度上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。和空白組比較轉(zhuǎn)染2組si MDM2的 MDM2／β-actin平均下調(diào)56.80%；wtP53／β-actin平均上調(diào)44.9%。如圖3

圖2 轉(zhuǎn)染后各組hepG2中MDM2mRNA和P53mRNA的表達(dá)的變化

2.4 siMDM2轉(zhuǎn)染后對(duì)hepG2細(xì)胞增殖的影響siRNA MDM2轉(zhuǎn)染后用MTT顯色法檢測(cè)96孔板細(xì)胞在不同時(shí)間的吸光值，根據(jù)存活細(xì)胞數(shù)量與吸光值呈正比的原理，按細(xì)胞增殖抑制率，轉(zhuǎn)染siMDM2后細(xì)胞的增殖速度和分裂指數(shù)均低于空白組，而且抑制率在0－72小時(shí)時(shí)間范圍內(nèi)隨時(shí)間的增加而增高（P＜0.05），如圖4。control siRNA和空白組比較細(xì)胞增殖差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組hepG2中MDM2mRNA和P53蛋白的表達(dá)的變化

圖4 轉(zhuǎn)染后各組hepG2細(xì)胞增殖抑制率

2.5 siMDM2轉(zhuǎn)染后對(duì)hepG2細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siMDM2-1，2后引起hepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生改變，使處于G0／G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少，如圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染后各組hepG2細(xì)胞周期變化

3 討論

MDM2可以與野生型P53蛋白形成復(fù)合體，對(duì)P53起負(fù)調(diào)節(jié)作用，使P53受到抑制或完全失活，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［5］。當(dāng)有致癌因素時(shí)，P53基因突變，失去抑癌功能，原癌基因MDM2被激活，表達(dá)相應(yīng)蛋白P90，通過(guò)與P53蛋白結(jié)合，進(jìn)一步使P53功能喪失，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［6］。研究表明，MDM2作為一個(gè)原癌基因，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，MDM2在一些軟組織肉瘤中的擴(kuò)增與表達(dá)和腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)。Zhang MF等［7］報(bào)道 MDM2癌基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌明顯過(guò)度表達(dá)，并可能參與腫瘤轉(zhuǎn)移，故認(rèn)為MDM2與肝癌的發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

SiRNA可以特異性地降解相應(yīng)基因的mRNA，從而抑制該基因的表達(dá)，siRNA每一條鏈均有2個(gè)核苷酸3′突出端，介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶mRNA分子而實(shí)現(xiàn)的，其作用類(lèi)似于基因敲除，但較其技術(shù)簡(jiǎn)單、快捷［8，9］。siRNA技術(shù)較其他單克隆抗體和反義核苷酸方法，具有更高的效率性和特異性：微量的siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量明顯下降，達(dá)到剔除的效果；同時(shí)，siRNA的抑制作用具有嚴(yán)格的序列特異性，治療的針對(duì)性強(qiáng)，副作用小。因此，siRNA技術(shù)為腫瘤基因治療提供了一個(gè)新的可供選擇的策略和技術(shù)平臺(tái)，siRNA技術(shù)可能成為治療人類(lèi)腫瘤和其他疾病的一個(gè)新的重要工具。

我們根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成了2對(duì)針對(duì)在肝細(xì)胞肝癌高表達(dá)的MDM2基因的干擾位點(diǎn)序列的siRNA MDM2。將構(gòu)建的siMDM2真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至hepG2細(xì)胞后進(jìn)行基因和凋亡的檢測(cè)。RT-PCR結(jié)果顯示siMDM2能有效地阻抑MDM2基因的表達(dá)，和空白組比較，平均基因表達(dá)下調(diào)64.7%；同時(shí)，增強(qiáng)P53基因的表達(dá)，和空白組比較，平均基因表達(dá)上調(diào)49.1%。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siMDM2能有效抑制hepG2細(xì)胞增殖，使細(xì)胞增殖速度減慢，且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)，增殖抑制率逐漸增加，差異具有顯著性，但轉(zhuǎn)染control si RNA組細(xì)胞增殖與空白組比為見(jiàn)明顯差異。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示siMDM2可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯：處于S期細(xì)胞減少，G0／G1和G2／M期細(xì)胞增多。而轉(zhuǎn)染control si RNA組細(xì)胞未見(jiàn)明顯細(xì)胞周期改變。

SiRNA MDM2能抑制MDM2基因和上調(diào)P53基因表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和使細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，本研究組已經(jīng)在siRNA MDM2對(duì)骨肉瘤增殖和凋亡的影響研究中證明了合成的siMDM2的有效性［10］，本研究進(jìn)一步證明了此重組質(zhì)?？梢砸种颇[瘤細(xì)胞增殖，提示在肝癌治療中，以MDM2基因?yàn)榘悬c(diǎn)，利用siRNA技術(shù)進(jìn)行基因治療有可能成為一種新的有效手段。本研究為后續(xù)的長(zhǎng)效抑制腫瘤的研究工作提供了新思路和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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siRNA inhibits MDM2expression and proliferation of hepatoma carcinoma cell

ZHAOYan-ying1，LIYa-gang1，YANGZe-cheng2，etal.（1.DepartmentofInternalMedicine，theFourthHospitalofJilinUniversity，Changchun130011，China；2.DepartmentofSurgery，China-JapanUnionHospital，JilinUniversity，Changchun130033，China）

ObjectiveUsing siRNA to downregulate MDM2expression in hepatocellular carcinoma cell line hepG2，to observe the influence of siRNA of cell proliferation and apoptosis.MethodsMDM2-siRNAs against the MDM2gene were designed and transfected into hepG2cells respectively，MDM2and P53gene and protein expression was measured using RT-PCR and western blot，Cell proliferation was measured with MTT assay，the cell cycle were analysed using flow cytometer.ResultsMDM2mRNA and protein expression were inhibited and P53mRNA and protein expression were enhanced after transfecting with two siRNA MDM2respectively.As a consequence，cell growth inhibition was observed，cell cycle change was observed after transfecting with two siRNA MDM2too.ConclusionsiRNA against MDM2could effectively downregulate MDM2and upregulate P53expression in hepG2cell line，inhibit cell proliferation and change cell cycle.

hepatocellular carcinoma；MDM2；si RNA；apoptosis

R735.7

A

1007－4287（2012）10－1790－04

＊通訊作者

2011－09－03）