徐 靜，萬家余，許 娜，許 琴，李 楠，王景龍，劉文森

（軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春 130122）

MALDI質譜成像的樣本制備技術及應用研究進展

徐 靜，萬家余，許 娜，許 琴，李 楠，王景龍，劉文森＊

（軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春 130122）

＊通訊作者

MALDI質譜成像技術（Maldi tof Imaging Mass Spectrometry，MALDI-IMS），是利用 MALDI質譜技術將得到的蛋白組學數據，結合計算機輔助成像產生分子圖像，進而描繪出組織上已知及未知分子分布情況的新技術。該技術已被廣泛應用于生命科學的很多領域，如動植物生理學、病理學［1－3］、藥物研發(fā)［4－6］等。

1 樣品制備技術

MALDI質譜成像實驗的關鍵是樣品的制備［7］，它主要包括冰凍切片的制備和基質的選擇及應用等。

1.1 冰凍切片的制備冰凍切片的制備是一項比較成熟的技術，但為了保證質譜成像結果的重復性和準確性，在質譜成像技術應用范圍不斷得到拓展的同時，組織樣品的儲存、包埋以及切片厚度選擇等方面也得到了不斷的優(yōu)化和改進。對于組織樣品的儲存，過去多推薦采用液氮快速冷凍后儲存于－80℃的方法，但新鮮組織放置于液氮中其內部會因受冷不均勻而導致組織裂開，常常影響實驗的重復性。Goodwin等［8］使用－70℃或更低溫度的乙醇或異丙醇代替液氮，經過多次實驗證明該方法在避免凍存組織裂開方面效果顯著。冷凍切片制備過程中包埋劑的選擇也值得關注，對于普遍使用的包埋劑OCT（Optimal cutting temperature polymer），由于其易離子化而使質譜信號強度下降，所以應盡量避免使用OCT包埋劑或使用OCT時避免污染樣本，現在多采用冰或聚合樹脂代替OCT來作為包埋劑［9］。切片的厚度對于MALDI-IMS實驗結果有很大影響，切片不易過厚，因為厚切片中一些對離子信號有干擾的物質不易被乙醇充分清洗掉，另外，切片越厚其表面覆蓋基質之后，相對于MALDI導電玻片的絕緣性就越強，所以薄切片具有較低的電荷效應，3－5μm厚度的冰凍切片易于得到質量較好的質譜圖，尤其適合檢測m／z較大分子［10］。

1.2 基質的選擇及應用高質量的 MALDI-IMS圖像從根本上依賴于高效的基質對分析物的沉淀。高效的基質可以從樣品中最大程度的抽提出分析物，同時限制分析物的擴散，且能夠產生比MALDI分辨率更小的結晶，MALDI-TOF的空間分辨率一般為25－50μm。MALDI-IMS實驗中常從選擇恰當的基質（表1）［11］及濃度，挑選合適的溶劑組分，使用高效的基質覆蓋方法方面來優(yōu)化實驗方案。合適的基質溶劑應既能將組織切片濕透、充分溶出分析物，同時又能快速干燥，有效避免樣品的遷移現象?；|的覆蓋方法原則上有兩種，噴霧法和點樣法。比較兩種方法，噴霧法在噴霧和干燥循環(huán)交替進行時易引起切片表面過濕，導致組織切片上分析物的位置遷移，另外基質結晶的尺寸和同質性也容易因為操作不同而受影響。點樣法產生的基質液滴體積為80－150pL，可形成直徑為100－200μm的圓形基質結晶區(qū)域，其在一定程度上限制了分析物的空間位置遷移，但圖像分辨率易受到基質斑的直徑和間距的影響。

具體在實驗中，要結合分析物性質來選擇。大量的實驗圍繞基質的選擇及運用方法的優(yōu)化展開，取得了很多寶貴的數據和經驗。此外，針對不同種類的研究對象，在基質應用方面科學家們進行了一些有益的探索值得借鑒，如Satu M.Puolitaival1等［12］實驗證明利用升華作用得到的基質層沉淀均勻，不易發(fā)生分析物空間位置遷移現象，特別適用于組織內磷脂分子成像。Ruibing Chen等［13］通過調整基質噴灑器的噴口與MALDI樣品靶之間的距離和噴射基質溶液的流速，產生相對干和濕兩種基質覆蓋狀態(tài)，分別采集質譜數據后比較結果發(fā)現，對于分子量小于900Da的脂類，這兩種基質覆蓋狀態(tài)下所得到的質譜信號強度和峰型基本沒有差別。

2 MALDI質譜成像在生命科學領域最新研究成果

2.1 基礎醫(yī)學研究中的應用MALDI質譜成像作為提供唯一全面的組織內分子分布信息的技術，已成為科學家研究生命體內各種生理和病理過程分子機制的最有力的手段。Vladimir等［14］利用MALDI質譜成像得到飽和烴、不飽和烴（HCs）和蠟酯（WEs）在灰色麻蠅的翅膀和腿部、普通果蠅翅膀以及椰棗樹葉表面的分布圖像，建立了在昆蟲及植物角質層表面直接進行脂類和烴類化合物分子成像的實驗方法，該方法正被應用于果蠅體表化學信息的研究中。

表1 常用的基質及應用范圍

Stephanie S.DeKe 等［15］利 用 MALDI-TOFTOF，進行甲殼類動物神經組織內神經肽的分子成像實驗，得到了兩種蟹（Jona h crab和cancer borealis）的腦和心包器官內神經調節(jié)輔助成分的分子分布圖像，建立了質譜成像實驗中復雜多樣的內源性信號分子的樣品制備方法。這種器官水平的質譜成像研究將有助于闡明同一神經肽家族內部不同神經肽亞型間的空間分布關系，以及不同神經肽家族之間的相對分布關系。

Yuki Sugiura等［16］利用MALDI質譜成像技術闡明了不同神經節(jié)苷脂分子的分布，尤其探明了按照神經鞘氨醇含碳原子數目分類的C18－神經節(jié)糖苷和C20-神經節(jié)糖苷的分布差異，前者廣泛的分布在前腦部位，后者選擇性的沿內嗅區(qū)到海馬投影區(qū)分布，尤其在齒狀回（DG）分子層分布較多。該實驗首次證明了神經節(jié)苷脂在腦內分布的選擇性，并推測這種選擇性與不同區(qū)域表達的神經節(jié)糖苷的功能差異有關。

2.2 藥物研發(fā)中的應用MALDI質譜成像技術在藥物研發(fā)方面有著廣泛的應用前景，如可用于藥物靶向篩選、組織器官或細胞內藥物及代謝產物分布等方面研究。Végvári等［17］設計了一種內置于壓力調控微芯片上的微量分配器平臺系統，其可耐受多種有機溶劑，最小可沉淀體積為100pL的基質液滴，并可通過軟件嘗試多種基質沉淀策略?；谠摶|覆蓋技術的MALDI質譜成像實驗，在肺組織切片中成功檢測到了治療肺慢性阻塞性疾?。–OPD）的藥物Tiotropium的兩個二級離子信號，分別是152.1和170.1Da，實驗結果證明該技術沉淀基質的重復性好，能形成指定厚度的基質層，非常適用于小分子藥物的研究。

2.3 疾病早期診斷中的應用MALDI質譜成像技術在尋找疾病生物標記物、研發(fā)疾病早期診斷方法等方面具有其他技術無法比擬的優(yōu)勢，已逐漸成為該領域內的研究熱點。Shuichi Shimma等［18］利用MALDI-IMS技術尋找人類結腸癌疾病的生物標記物，由于磷脂在細胞膜組分中發(fā)揮重要的作用，所以將其作為重要檢測目標，實驗最終發(fā)現兩種磷脂分子存在明顯的表達差異，并使用MS／MS技術進行了鑒定，可作為該病潛在的生物標志物進行進一步研究。

A.F.Maarten Altelaar等［19］利用 MALDI質譜成像進行了大白鼠、小白鼠及人腦垂體內神經肽的序列差異分析，由于垂體切片?。ㄖ睆?02－103 μm），實驗中將 MALDI-IMS技術分別與離子顯微鏡和 TIC（total-ion-count）成像技術結合使用，得到500nm的像素點和4μm的空間分辨率，彌補了MALDI-IMS分辨率相對較低的弱點。這一技術可用于尋找正常組織病變后小肽或蛋白質發(fā)生的氨基酸序列異常變化（如：氨基酸置換、翻譯后修飾改變等），這將對于疾病的快速診斷具有重要意義。

Siddharth S.Samsi等［20］提出了一種區(qū)分濾泡性淋巴瘤的類別的系統化實驗方法，將甲醛固定石蠟包埋的組織塊，切成5μm厚的切片，進行切片原位酶解后 MALDI質譜成像分析，同時進行H＆E染色分析，再將質譜成像得到的蛋白組學數據結合組織形態(tài)學，有望發(fā)展一種新的診斷工具，即通過MALDI質譜成像區(qū)分濾泡、套膜、濾泡內區(qū)域，進而更加準確的對濾泡性淋巴瘤進行診斷和分類。

3 結語

MALDI質譜成像技術發(fā)展迅速，與其他成像技術相比存在顯著優(yōu)勢。首先，其所得到的質荷比（m／z）信息是以分子的原子組成為基礎，是已被普遍采用的參數，該技術不需要對分析物進行標記，便可對未知分子成像；其次，借助質譜儀的高分辨率，還可以區(qū)分分子間的細微差別；第三，盡管次級離子質譜（SIMS）的分辨率可達1μm，明顯高于 MALDI，但SIMS質量測量范圍明顯不及MALDI。另外，MALDI儀器的廣泛應用，也是其快速發(fā)展的重要原因之一。

MALDI質譜成像技術作為快速、直觀的蛋白組學研究工具前景十分廣闊，但在具體實驗中還存在很多技術上的難題。一方面，在研究藥物及其代謝產物組織內分布方面，由于藥物分子在組織細胞內含量低，對實驗靈敏度要求較高，因此實驗中基質選擇及應用方法方面仍需要進行較多的嘗試［21，22］。另一方面，利用質譜成像技術篩選得到的未知蛋白質的鑒定相對小肽的鑒定仍存在較多困難，使用顯微切割系統結合標準的蛋白組學方法對組織切片上目的蛋白進行鑒定，或者對組織切片原位酶解后利用二級質譜方法對肽段進行鑒定，均易受到組織上目的蛋白的彌散分布、蛋白水解過程或者目的蛋白豐度較低等因素的干擾，而很難得到令人滿意的實驗結果。因此，建立完善和成熟的 MALDI質譜成像實驗方法仍然是這一技術優(yōu)勢得到充分發(fā)揮的前提和基礎。

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1007－4287（2012）10－1939－04

國家自然科學基金（30972197）

徐靜，31歲，女，碩士，助理實驗師，研究方向：瘋牛病發(fā)病機制研究。

2012－06－16）