趙 雷

（長春中醫(yī)藥大學教務(wù)處，吉林 長春 130117）

姜黃素誘導雄性激素依賴性前列腺癌LNCaP多耐藥細胞凋亡

趙 雷

（長春中醫(yī)藥大學教務(wù)處，吉林 長春 130117）

前列腺癌細胞的多耐藥性（multidrug-resistance，MDR）常常導致臨床上前列腺腫瘤化療的失敗。研究耐藥機制，尋找分子靶點，研發(fā)高效、低毒的MDR抑制劑是目前面臨的挑戰(zhàn)。研究表明，化療藥物誘導凋亡耐受在前列腺腫瘤細胞MDR形成過程中起著十分重要的作用。因此，尋找前列腺癌多耐藥抑制劑，促進細胞凋亡可以在很大程度上降低前列腺癌MDR。

姜黃素（Curcumin，Cur）是一種從姜黃根莖中提取得到的黃色色素［1］。姜黃素有重要和廣泛的藥理作用，如降血脂、抗氧化、抗發(fā)炎［2］、抗動脈粥樣硬化等［3］。2004年時發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制HIV-1整合酶活性而用于艾滋病的臨床試驗。此外，抗癌是姜黃素的主要藥理活性之一，其抑制腫瘤的作用已在許多動物實驗中得到反復證實，其具體抗癌機制已成為近期研究熱點［4，5］。

NF-κB（nuclear factor-κB）是一種分布和作用均十分廣泛的真核細胞轉(zhuǎn)錄因子，通過多條信號通路與腫瘤細胞的多耐藥性相關(guān)［6］。王漪等2007年研究發(fā)現(xiàn)，白血病細胞中NF-κB調(diào)控 MDR1基因，參與耐藥逆轉(zhuǎn)［7］。研究表明，NF-κB、Bcl-2、p53和c-jun等分子與前列腺腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切［8，9］。

本研究的目的在于研究姜黃素與NF-κB信號通路的聯(lián)系，及其誘導雄性激素依賴性前列腺癌LNCaP多耐藥細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株雄性激素依賴性前列腺癌細胞系LNCaP購自上海細胞庫，用DMEM培養(yǎng)基（含15%牛血清）在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化傳代用0.25%胰蛋白酶液。多耐藥細胞的制備參考文獻［10］。

1.2 試劑姜黃素購自Sigma公司；總蛋白提取、總RNA提取試劑盒購自Promega。鼠源單克隆抗體：NF-κB抗體、磷酸化c－jun抗體、P-gp（P-glycoprotein）抗體、p53抗體、bcl-2抗體、GAPDH抗體購自ABCam。HRP標記羊抗鼠二抗購自abcam。甲唑藍（MTT）購自Sigma；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Promega；2×SYBR real-time PCR試劑盒購自Roche公司；BCA蛋白定量試劑盒，ECL發(fā)光檢測試劑盒購自Pierce。

1.3 姜黃素培養(yǎng)細胞細胞以1×106／ml的濃度接種到6孔板，孔內(nèi)放2ml DMEM（10%小牛血清），培養(yǎng)24h。換新鮮培養(yǎng)液，其中含有溶解的不同濃度姜黃素。繼續(xù)培養(yǎng)48h，分別用real-time PCR和 western blot檢測 NF－κB、Bcl-2、p53、磷酸化c－jun，用MTT檢測細胞增殖。抑制腫瘤的生長率＝（無藥對照孔OD值－用藥孔OD值）／無藥對照孔OD值×100%。未添加姜黃素的細胞作為對照。

1.4 QPCR收集細胞，用試劑盒提取總RNA，MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板按照試劑盒操作說明進行real-time PCR，每個反應(yīng)體系中均加入GAPDH的一對引物作為PCR擴增的內(nèi)參，反應(yīng)條件：95℃30s-56℃60s-72℃60s，35個循環(huán)。用 Beacon designer 7根據(jù)Genbank序列設(shè)計引物，經(jīng)過Blast驗證，上海生工引物合成和基因測序。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測收集PC-3M／CDDP細胞，按照試劑盒說明，用真核細胞裂解液裂解，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量。用12%SDS-PAGE凝膠進行電泳，凝膠通過濕轉(zhuǎn)裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜后，將膜置于封閉液（含10% 脫脂奶粉的PBST）中，于搖床搖勻1h。用TBST清洗三次，每次5min，棄清洗液。稀釋一抗（1∶1000）于封閉液中。將膜置于一抗液中，室溫搖床1h。用TBST清洗三次，每次5 min，棄去清洗液。稀釋 HRP標記二抗（1：500）于封閉液。將膜置于上述液中室溫搖床1h。用TBST清洗3次，每次5 min，棄去清洗液。ECL試劑盒顯色，X膠片定影。采用GAPDH蛋白內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)用±S表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計分析軟件進行分析。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

未姜黃素處理細胞的 NF－κB、磷酸化c－jun和bcl-2蛋白質(zhì)水平比較高，p53蛋白水平低，說明細胞凋亡水平低，而NF-κB信號通路、JNK信號通路活性高。P-gp是mdr1基因表達的蛋白質(zhì)，其水平高，說明存在較高的細胞多耐藥。姜黃素作用后，NF-κB、磷酸c-jun、bcl-2蛋白水平顯著下降，說明NF－κB、JNK信號通路明顯受到抑制。此外，p53蛋白水平顯著升高，說明細胞凋亡增加。P-gp水平顯著降低，則細胞多耐藥性顯著減小。相應(yīng)的灰度值見表2。

表2 各分子相對GAPDH的blot灰度值（48h，%）

LNCaP細胞48h生長率約為92%。不同濃度姜黃素作用后，細胞48h生長率顯著下降，分別是變成30%、17%、3%。

3 討論

腫瘤MDR能夠抵抗臨床藥物的抗腫瘤作用，并且阻抑MDR腫瘤凋亡。本研究中，姜黃素作用于雄性激素依賴性前列腺癌 MDR細胞以后，NF-κB信號通路降低，mdr1／P-gp表達水平下降，bcl-2表達減少，c-Jun磷酸化減弱，而p53表達水平卻顯著升高，MDR細胞的凋亡顯著升高、MDR則顯著下降。相應(yīng)的，細胞生長也受到顯著抑制。

前列腺癌細胞耐凋亡與NF-κB信號通路相關(guān)聯(lián)。本研究中，雄性激素依賴性前列腺癌MDR細胞經(jīng)過姜黃素的作用，NF-κB信號通路受到顯著抑制，級聯(lián)反應(yīng)導致磷酸c－jun水平顯著下降，抑制JNK信號通路。NF-κB信號減低也造成了mdr1／P-gp表達的顯著降低［7］，腫瘤 MDR逆轉(zhuǎn)成為藥物敏感。

細胞凋亡過程復雜，包括多個基因的調(diào)控［11］。前列腺癌細胞表達p53、bcl-2和c-jun，其中p53上調(diào)指示細胞凋亡啟動，并且p53對于NF－κB存在相反關(guān)聯(lián)的效應(yīng)。NF-κB信號可以通過上調(diào)下游bcl-2表達、增強c-jun信號磷酸化激活JNK信號通路，抑制化療藥物誘導型細胞凋亡，最終細胞出現(xiàn)耐藥。在本研究中，姜黃素作用，減低了NF－κB信號，并導致下游bcl-2顯著下調(diào)，以及c－jun磷酸化水平減弱。作為相反關(guān)聯(lián)的凋亡蛋白p53表達則顯著增強，MDR前列腺癌細胞的抗凋亡作用顯著減弱并啟動凋亡進程，然后，細胞生長受到顯著抑制。

總之，本研究結(jié)果表明，前列腺癌細胞MDR可能與NF－κB信號介導的抗凋亡作用有關(guān)，因此，NF-κB信號可能作為前列腺癌治療的分子靶點。并且，姜黃素作用于MDR前列腺癌細胞，抑制NF－κB信號，下調(diào)bcl-2和磷酸化c－jun水平，抑制抗凋亡基因，減小癌細胞MDR，因此，姜黃素有可能治療MDR前列腺癌。

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1007－4287（2012）10－1920－02

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