王 煒，陳曉萌，金 曄

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京100050）

銅綠假單胞菌是假單胞菌屬中的代表菌種。最早是在1882年從病人化膿的傷口中分離出來(lái)，因產(chǎn)綠色色素，故俗稱綠膿桿菌。銅綠假單胞菌是革蘭染色陰性細(xì)菌，有鞭毛和莢膜，致病菌株有菌毛，一般不形成芽胞，常常感染免疫力低下的病人，引起菌血癥、敗血癥、傷口感染、泌尿系統(tǒng)感染和囊性纖維化等疾病。

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染重要的條件致病菌，在醫(yī)院感染中占有非常重要的地位。在美國(guó)，銅綠假單胞菌感染占醫(yī)院感染的10%，是肺囊性纖維化病人合并肺部感染的首要病原，是導(dǎo)致醫(yī)院獲得性肺炎的第2位病原，約17%的醫(yī)院獲得性肺炎為該細(xì)菌導(dǎo)致，同時(shí)該菌可引起11%左右的尿路感染，8%的手術(shù)部位感染，3%的血液感染［1］。本文探討水解酶的產(chǎn)生是否銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥表現(xiàn)的主要機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2010年5月－2011年5月，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心細(xì)菌室分離的來(lái)自不同患者的銅綠假單胞菌159株。經(jīng)VITEK2全自動(dòng)微生物分析儀（法國(guó)生物梅里埃公司）鑒定為銅綠假單胞菌。

質(zhì)量控制菌株：大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853。為我實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.2 受試藥物

見表1。

表1 抗菌藥物來(lái)源、批號(hào)和效價(jià)

濃度梯度按照CLSI 2010版對(duì)敏感、中介、耐藥的解釋標(biāo)準(zhǔn)自行設(shè)計(jì)。

1.3 儀器及試劑

培養(yǎng)基：血瓊脂平板培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基（天津金章公司）

Mueller－Hinton（M－H）瓊脂為紙片擴(kuò)散法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)用培養(yǎng)基（MH培養(yǎng)基干粉為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品）

藥敏板：96孔藥敏板購(gòu)自天津金章公司

生物安全柜（Thermo Scientifc 1300，美國(guó)）

電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP－9162，上海）

比濁儀（生物梅里埃Vitek，法國(guó)）

微量移液器（eppendorf，德國(guó)）

1.4 方法

1.4.1 抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定以下抗菌藥物對(duì)試驗(yàn)菌株的最低抑菌濃度MIC，抗菌藥物包括亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、舒巴坦／頭孢哌酮、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、妥布霉素、阿米卡星、氨曲南、他唑巴坦／哌拉西林、多粘菌素B。各藥物濃度為試驗(yàn)者自行設(shè)計(jì)、配制。所有MIC數(shù)據(jù)參照CLSI（Clinical And Laboratory Standards Institute，美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)）2010版M100－S20文件解釋。

1.4.2 三維水解試驗(yàn)檢測(cè)β－內(nèi)酰胺酶 ①試劑的配制：克拉維酸溶液2 mmol／L，鄰氯西林溶液2 mmol／L，EDTA－Na2溶液（100 mmol／L）。②粗提酶的制備：將新分離的待檢菌密涂于1／4 MH瓊脂平板（Φ＝90 mm）上，35℃培養(yǎng)24 h后，用滅菌棉棒取下全部菌苔于1 ml滅菌生理鹽水中（用1.5 ml離心管）。將離心管置－70℃低溫冰箱凍融5次（凍2 h以上，再取出融化），在4℃條件下13 000 r／min離心1 h，抽取上清液，用0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾，取1滴粗提酶液接種于 MH瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)24 h后，以無(wú)菌生長(zhǎng)為合格的粗提酶液。③酶型檢測(cè)：將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏臉?biāo)準(zhǔn)大腸桿菌ATCC25922菌液涂抹于MH瓊脂平板上，10 min后于平板中央貼一片30μg IPM紙片，距紙片邊緣5 mm處垂直打4個(gè)1 mm寬10 mm長(zhǎng)的槽，分別于槽內(nèi)加40μl粗提酶液、粗提酶液（36μl）＋CLO（4μl）、粗提酶液（36μl）＋CLA（4μl）及粗提酶液（36μl）＋CLO（4μl）＋CLA（4μl）把含10μg／片亞胺培南（IPM）貼于 MH平板，分別在距亞胺培南紙片邊緣5 mm處，挖2個(gè)1×10 mm的槽，分別于槽內(nèi)加40μl粗提酶液、粗提酶液（36μl）＋EDTA－Na2（4μl），置35℃培養(yǎng)24 h。④酶型判斷：當(dāng)抑菌環(huán)出現(xiàn)缺損，形成一指向藥敏紙片的矢狀菌苔，即酶水解實(shí)驗(yàn)呈陰性。加入酶抑制劑時(shí)，CLA單獨(dú)加入時(shí)抑酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，即該菌ESBL檢測(cè)陽(yáng)性。CLO單獨(dú)加入時(shí)抑酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，即該菌AmpC酶檢測(cè)陽(yáng)性。CLO或CLA單獨(dú)加入不能抑制酶活性（抑酶試驗(yàn)陰性），同時(shí)加入CLO和CLA時(shí)抑酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，說(shuō)明該菌同時(shí)產(chǎn)生Amp C和ESBLs兩種酶。當(dāng)同時(shí)加入CLO和CLA時(shí)抑酶試驗(yàn)仍為陰性，該菌可能產(chǎn)生耐抑制劑廣譜酶；若EDTA單獨(dú)加入時(shí)抑酶試驗(yàn)陽(yáng)性，即該菌金屬β內(nèi)酰胺酶（MBL）陽(yáng)性。見圖1。

2 結(jié)果

圖1 三維水解試驗(yàn)檢測(cè)β－內(nèi)酰胺酶陰性

表2 159株碳青霉烯耐藥的銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的藥敏結(jié)果

159株臨床分離的非重復(fù)銅綠假單胞菌，單藥MIC顯示試驗(yàn)中銅綠假單胞菌對(duì)于CLSI2010推薦和臨床常用抗菌藥物（碳青霉烯類、頭孢菌素類、β－內(nèi)酰胺類／β－內(nèi)酰胺酶抑制劑類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類）敏感率低，呈現(xiàn)多重耐藥表型，見表2。多重耐藥銅綠假單胞菌（multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa MRPA）的納入標(biāo)準(zhǔn)為：抗菌藥物耐藥種類大于5類（碳青霉烯類、頭孢菌素類、β－內(nèi)酰胺類／β－內(nèi)酰胺酶抑制劑類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類）；尤其是對(duì)于頭孢哌酮／舒巴坦、哌拉西林／他唑巴坦耐藥性為100%，對(duì)于頭孢吡肟、氟喹諾酮類、氨基糖苷類大約半數(shù)細(xì)菌呈現(xiàn)耐藥，對(duì)于多粘菌素B細(xì)菌全部呈現(xiàn)敏感。推測(cè)出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因是臨床對(duì)于β－內(nèi)酰胺／β－內(nèi)酰胺酶抑制劑的使用偏好，經(jīng)驗(yàn)用藥使用此類藥物比例較大，容易出現(xiàn)耐藥情況。多粘菌素主要作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的重要物質(zhì)外漏，為慢效殺菌劑。很少通過(guò)消化道吸收，主要通過(guò)腎臟排出，故腎功能不全者應(yīng)減少劑量。多粘菌素類不良反應(yīng)明顯，主要為腎毒性和神經(jīng)毒性，但多粘菌素的抗菌作用強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐藥性，故當(dāng)各種革蘭陰性桿菌對(duì)其他抗菌藥物耐藥或療效不佳時(shí)，仍可作為選用藥物。臨床可供選用的是多粘菌素B和多粘菌素E。多粘菌素E在腎、肝、肺等組織中濃度比多粘菌素B高，但不易通過(guò)無(wú)炎癥的血腦屏障［2－4］。

表3 159株銅綠假單胞菌對(duì)7類抗生素的耐藥情況

水解酶驗(yàn)證：通過(guò)三維實(shí)驗(yàn)159株P(guān)a中檢測(cè)出產(chǎn)MBL15株，Amp C酶13株；說(shuō)明水解酶的產(chǎn)生不是本院多重耐藥銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。

3 討論

銅綠假單胞菌主要是在抗菌藥物的選擇壓力下耐藥率不斷上升，其耐藥機(jī)制比較復(fù)雜：可通過(guò)產(chǎn)生金屬β－內(nèi)酰胺酶水解碳青霉烯類抗菌藥物；可通過(guò)Opr D2蛋白特異性通道表達(dá)減少或缺失減少亞胺培南的進(jìn)入；通過(guò)群體性生物被膜的形成減少抗菌藥物的攝入；對(duì)已經(jīng)進(jìn)入的抗菌藥物還可通過(guò)主動(dòng)外排系統(tǒng)泵出。但對(duì)不同碳青霉烯耐藥機(jī)制有所差異，亞胺培南耐藥主要涉及外膜蛋白缺失；美羅培南耐藥則需細(xì)菌主動(dòng)外排表達(dá)增加；金屬酶及生物被膜的產(chǎn)生可能導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)所有碳青霉烯類耐藥。銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制極為復(fù)雜，這四種機(jī)制可單獨(dú)發(fā)揮作用，也可聯(lián)合發(fā)揮作用，但是也有研究證明外排泵在生物被膜耐藥中無(wú)作用［5－7］，現(xiàn)在還不斷有新的耐藥機(jī)制被發(fā)現(xiàn)。本試驗(yàn)只在細(xì)菌的表型方面檢測(cè)了159株銅綠假單胞菌是否產(chǎn)生金屬酶或者頭孢菌素酶，未進(jìn)一步檢測(cè)其它水解酶，下一步實(shí)驗(yàn)要進(jìn)一步完善。對(duì)于以上的耐藥機(jī)制我們還應(yīng)進(jìn)行更深入的研究，指導(dǎo)臨床合理用藥，并積極開發(fā)新的抗菌藥物來(lái)針對(duì)這些耐藥機(jī)制。同時(shí)因?yàn)檫@些耐藥機(jī)制都是在抗菌藥物（尤其是第三代頭孢菌素）的選擇壓力下產(chǎn)生或加強(qiáng)的，我們要倡導(dǎo)合理、適量、分階梯的使用抗菌藥物，并對(duì)當(dāng)?shù)刂匾幬镞M(jìn)行周期性耐藥監(jiān)測(cè)，提倡個(gè)性化選擇藥物，針對(duì)不同的臨床藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用不同的抗菌藥物，尤其是在治療過(guò)程中耐藥性的演變。減緩銅綠假單胞菌耐藥的產(chǎn)生和發(fā)展，最大限度的減少多重耐藥的銅綠假單胞菌出現(xiàn)，從而保障人民群眾的生命健康。

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