羅雁非，丁 旭，文 雪，張曉靜，李洪軍，何成彥，趙麗純＊

（1.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春130021：3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033）

志賀氏菌（Shigella）又稱痢疾桿菌，是一類以引起腹瀉癥狀為主的常見致病菌，據(jù) WHO報(bào)道，世界上每年有1.65億感染志賀氏菌，年死亡人數(shù)達(dá)110萬，99%發(fā)病人數(shù)在發(fā)展中國家，尤其是衛(wèi)生條件差的地區(qū)，以5歲以下的兒童為主［1］。多種致病菌導(dǎo)致的腸道傳染病嚴(yán)重威脅著人類健康。致病菌的實(shí)驗(yàn)室金標(biāo)準(zhǔn)鑒定手段仍然是培養(yǎng)、血清學(xué)和生化等傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測方法，步驟相對繁瑣，一般需要數(shù)天才能得到結(jié)果，給檢驗(yàn)帶來不便。因此建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的致病菌檢測方法對此類傳染病的早期判定至關(guān)重要。近年來，PCR和核酸雜交技術(shù)的應(yīng)用，促進(jìn)了細(xì)菌檢測技術(shù)的發(fā)展［2］。侵襲性質(zhì)?？乖璈基因（invasion plasmid antigen H，ipaH，IPaH）是同時(shí)存在于痢疾桿菌染色體和侵襲性大質(zhì)粒上的侵襲基因。通過分子生物學(xué)方法檢測IPaH基因，可以快速檢測腹瀉患者糞中的痢疾桿菌，且在發(fā)病率評估上比細(xì)菌培養(yǎng)法靈敏準(zhǔn)確［3－5］。但目前未見通過PCR法全面系統(tǒng)檢測IPaH1基因在鮑氏志賀氏菌、野生志賀氏菌、大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等常見致病菌中的表達(dá)的報(bào)道。因此本研究檢測了IPaH1基因在志賀氏菌等幾種常見腸道致病菌中的表達(dá)，以確定IPaH1基因在志賀氏菌表達(dá)的特異性，為進(jìn)一步進(jìn)行ipaH1基因液態(tài)芯片的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及來源

實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株及其來源見表1。

表1 菌種及來源

標(biāo)準(zhǔn)株均采購于北京中原公司，分離株來自吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑和儀器

LB培養(yǎng)基、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基（TSB－YE）、氯化鈉蔗糖培養(yǎng)基、氯化鈉結(jié)晶紫增菌液、亞硫酸鹽－多粘菌素－磺胺嘧啶瓊脂（SPS）（液體硫乙醇酸鈉等購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司、Wizard○RGenomic DNA Purification Kit 試 劑 盒（Promega）、2×Easy Taq PCR SuperMix、瓊脂糖、100bp DNA Ladder Marker（大連寶生物）、DL2000 DNA Ladd er Marker（大連寶生物）等。

恒溫培養(yǎng)箱（德國Binder）、水浴箱（美國Shellab）、PCR儀（美國 ABI）、電泳儀（PS500A）、Alphalmager EC紫外凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Alpha）等。

1.3 引物

根據(jù)GenBank上IPaH－1基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對引物，以16srRNA作為內(nèi)參基因。由上海捷瑞生物工程公司合成，序列如表2。

表2 引物序列

1.4 菌株的培養(yǎng)

鮑氏志賀氏菌、野生志賀氏菌、大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌用LA平板，糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單增生李斯特菌用TSA平板，37℃溫箱過夜培養(yǎng)，然后挑取單菌落接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，37℃水浴振蕩培養(yǎng)過夜；副溶血性弧菌用氯化鈉蔗糖平板37℃溫箱過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種到氯化鈉結(jié)晶紫增菌液，37℃水浴振蕩培養(yǎng)過夜；產(chǎn)氣莢膜梭菌用SPS平板37℃厭氧培養(yǎng)24－48h，然后挑取黑色單菌落于液體硫乙醇酸鈉中37℃過夜培養(yǎng)。

1.5 細(xì)菌基因組DNA的提取

按照 Promega Wizard？Genomic DNA Purification Kit試劑盒使用說明操作，簡述如下：取1ml過夜培養(yǎng)物至1.5ml離心管中；13，000r／mim 離心2min收集菌體；加入600μl核裂解液重懸菌體；80℃ 孵育5min裂解細(xì)胞，冷卻至室溫；加入3μl RNA酶溶液，顛倒5次；37℃孵育35min，冷卻至室溫；加入200μl蛋白沉淀液，劇烈振蕩20s，冰上孵育5min；13，000r／mim離心3min；移上清至一離心管中，加入600μl異丙醇；輕輕顛倒混勻；13，000 r／mim離心2min；棄上清；加入600μl 70%乙醇，輕柔顛倒離心管數(shù)次；13，000r／mim 離心2min。小心吸去乙醇，將離心管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥15min；加入100μl DNA溶解液，4℃ 孵育過夜后，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR擴(kuò)增目的基因

PCR反應(yīng)體系（25μl）：2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5μl；上、下游引物（10μM）各0.5μl；基因組DNA 模板1ng／μl 1μl；無菌水定容至25μl。循環(huán)參數(shù)：95℃ 2min；94℃ 45sec、52℃ 30sec、72℃30sec，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸5min。

1.7 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

1.7.1 退火溫度優(yōu)化：PCR體系中各成分濃度不變，反應(yīng)程序，退火溫度依次為49.0℃，50.0℃，51.0℃，52.0℃，53.0℃，54.0℃，55.0℃，56.0℃，57.0℃，58.0℃，59.0℃。

1.7.2 引物濃度優(yōu)化：PCR反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)程序不變，其他成分濃度不變，引物終濃度依次為0.02μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 IPaH1在幾種腸道致病菌的表達(dá)

以鮑氏志賀氏菌、野生志賀氏菌、大腸埃希菌、出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，結(jié)果可見IPaH1－1、IPaH1－2兩對引物均在志賀氏菌擴(kuò)增出較高表達(dá)水平的目的條帶，片段長度與預(yù)期一致，其他11種菌均為陰性，見圖1A、B。

A：引物為IPaH1－1；B：引物為IPaH1－2；M：DL 2000Marker；1－14的模板依次為：志賀氏菌ATCC 9207，志賀氏菌JL 08036，大腸埃希菌，出血性大腸埃希氏菌（O157：H7），腸炎沙門氏菌，阪崎腸桿菌，普通變形桿菌，蠟樣芽孢桿菌，糞腸球菌，金黃色葡萄球菌，單核細(xì)胞增生李斯特菌，副溶血性弧菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌，空白對照

2.2 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

以鮑氏志賀氏菌基因組DNA為模板，對退火溫度、引物濃度及模板濃度等PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1 退火溫度的優(yōu)化

結(jié)果顯示，引物IPaH1－1在55.0℃－59.0℃退火溫度下，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶均很清晰，表明該反應(yīng)體系的最佳退火溫度在55.0℃－59.0℃之間；引物IPaH1－2在51.0℃－55.0℃條帶均很清晰，說明該反應(yīng)體系的最佳退火溫度在51.0℃－55.0℃之間；如圖2、3所示。以下實(shí)驗(yàn)反應(yīng)中以56℃為引物IPaH1－1的退火溫度，以52℃為引物IPaH1－2的退火溫度。

圖2 退火溫度對IPaH1基因擴(kuò)增的影響引物（引物為IPaH1－1）

圖3 退火溫度對IPaH1基因擴(kuò)增的影響引物（引物為IPaH1－2）

2.2.2 引物濃度的優(yōu)化

結(jié)果顯示，引物IPaH1－1、IPaH1－2終濃度為0.1μM時(shí)擴(kuò)增條帶已經(jīng)很清晰，圖4。

圖4 引物濃度對IPaH1基因擴(kuò)增的影響

3 討論

志賀氏菌引起腸道傳染病發(fā)病率位居法定傳染病之首，嚴(yán)重危害人們的身體健康，因此建立比傳統(tǒng)檢測方法更快速、準(zhǔn)確、實(shí)用的檢測方法尤為重要［6］。近年來，建立了一些新的檢測方法，如PCR檢測技術(shù)和基因芯片技術(shù)等分子生物學(xué)檢測技術(shù)。這些檢測技術(shù)在很大程度上依賴于PCR擴(kuò)增，特別是多重PCR，對于引物的要求更高。我們設(shè)計(jì)引物時(shí)，根據(jù)志賀氏菌毒力基因表達(dá)產(chǎn)物侵襲性質(zhì)?？乖?H基因（ipaH）、侵襲相關(guān)基因（ial）、志賀菌腸毒素1基因（ShET－1）和志賀菌腸毒素2基因（ShET－2）［7，8］。但志賀氏菌同許多病原菌一樣都存在毒力相關(guān)基因也稱毒力島［9］，這對志賀氏菌特異性引物的設(shè)計(jì)增加了難度。

1987年Buysse等［10］發(fā)現(xiàn)IPaH以多拷貝同時(shí)存在于各型志賀氏菌染色體和侵襲性大質(zhì)粒上，不隨傳代而丟失。以IPaH設(shè)計(jì)引物建立PCR檢測方法具有較高敏感性并可避免因基因突變、質(zhì)粒丟失而導(dǎo)致的假陰性。已有研究以IPaH基因擴(kuò)增為基礎(chǔ)進(jìn)行了IPaH4.5的功能研究［11］。本文根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則和相關(guān)信息設(shè)計(jì)了包括管家基因在內(nèi)的七對引物（未全部列出），從中篩選出符合分子生物學(xué)檢測志賀氏菌IPaH1基因表達(dá)，具較高特異性的兩對引物，在大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌（O157：H7）、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌未見表達(dá)；并從退火溫度、引物濃度方面對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，兩對引物理想終濃度均為0.1μM，最適退火溫度分別為55.0℃－59.0℃、51.0℃－55.0℃。本研究結(jié)果為進(jìn)一步建立IPaH1基因液態(tài)芯片檢測系統(tǒng)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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