翁叢叢，方益民，黃潤巧，林冬冬，張洪勤，施孟如

（溫州醫(yī)學院，浙江 溫州 325035，1.生物系；2.生物學教學中心）

大腸桿菌不同SOD調(diào)控序列紅色熒光蛋白報告基因載體的構建及功能鑒定

翁叢叢1，方益民1，黃潤巧1，林冬冬1，張洪勤2，施孟如2

（溫州醫(yī)學院，浙江 溫州 325035，1.生物系；2.生物學教學中心）

目的：通過將大腸桿菌BL21中MnSOD、FeSOD以及Cu/ZnSOD調(diào)控序列（包括啟動子，-3518～+15 bp）與紅色熒光蛋白（RFP）連接，構建成含SOD調(diào)控序列的紅色熒光蛋白報告基因，用以研究不同SOD啟動子對RFP的調(diào)控作用。方法：采用重組PCR技術，分別構建以MnSOD、FeSOD、Cu/ZnSOD啟動子驅動的RFP報告基因載體，并將構建的融合基因通過T克隆轉化入大腸桿菌，通過不同濃度Cd2+作用，分別誘導RFP表達。結果：正確構建了三種SOD-RFP融合基因，重組PCR結果與測序結果完全一致；該報告基因在室溫靜息狀態(tài)下，紅色熒光有微弱表達，經(jīng)Cd2+誘導后，紅色熒光亮度明顯增強，其中MnSOD調(diào)控序列驅動的RFP表達最為明顯。結論：該報告基因載體的成功構建，為研究SOD的基因表達調(diào)控機制和研制檢測環(huán)境中污染物的微生物傳感器提供了重要基礎和工具。

超氧化物歧化酶；調(diào)控序列；重組PCR；紅色熒光蛋白；基因，報告；大腸桿菌

當處于極端溫度、重金屬等環(huán)境中，生物體氧自由基產(chǎn)生過多或對氧自由基清除能力下降，氧自由基通過鏈式自由基反應損傷細胞。機體清除氧自由基的過程主要包括超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD)將氧自由基通過歧化反應轉變?yōu)镠2O2，隨后過氧化氫酶（CAT）將H2O2轉變?yōu)镺2和H2O[4]。SOD是一種廣泛存在于生物體中的金屬酶，根據(jù)其所結合的金屬離子的不同，可分為MnSOD（SODA）、FeSOD（SODB）、Cu/ZnSOD（SODC）三種類型[1-3]。段學軍等[5]的研究表明，機體總SOD活性會隨著重金屬的刺激而增加，然而具體是哪一種SOD起主導作用尚未能闡明。因此，本實驗應用重組PCR技術，分別構建以SODA、SODB、SODC啟動子驅動的紅色熒光蛋白（RFP）報告基因載體，經(jīng)不同濃度Cd2+刺激，誘導RFP基因表達，通過檢測RFP熒光強度變化，從而研究不同SOD啟動子在Cd2+誘導下對RFP的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 RFP報告基因和菌種：含RFP基因的大腸桿菌BL21由浙江大學惠贈。

1.1.2 主要儀器及試劑：Tanon-1600R凝膠成像分析儀（上海天能科技有限公司），PCR梯度擴增儀（德國EPPENGERF，AG），Centrifuge 5415高速冷凍離心機（德國，EPPENDORF），RF-5301PC熒光分光光度計（SHIMADZU），F(xiàn)V1000激光共聚焦顯微鏡（Olympus），柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（中國捷瑞生物工程有限公司），T4DNA連接酶（5 U/L）（寶生物工程有限公司），DNA ladder（中國捷瑞生物工程有限公司），pMD18-T克隆試劑盒（寶生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物：表1中的十個引物為自行設計，根據(jù)GenBank里大腸桿菌BL21（NC_012971）的SODA、SODB、SODC基因調(diào)控序列，及浙江大學惠贈的RFP基因，用Primer Premier 5.0軟件完成引物設計，引物由上海捷瑞公司合成（見表1）。

表1 PCR引物及條件

1.2.2 SODA、SODB、SODC以及相應重疊區(qū)域的RFP基因的擴增：挑取一個含RFP基因質(zhì)粒的大腸桿菌BL21菌落到100 mL ddH2O中懸浮混勻，100 ℃沸水浴10 min，冰浴3 min，12000 r/min離心5 min，取上清液為DNA模板，以引物SOA-RFP-1L和SODARFP-2R用于擴增SODA，SODA-RFP-3L和SOD-RFP-4R用于擴增RFP；SODB-RFP-1L和SODB-RFP-2R用于擴增SODB，SODB-RFP-3L和SOD-RFP-4R用于擴增RFP；SODC-RFP-1L和SODC-RFP-2R用于擴增SODC，SODCRFP-3L和SOD-RFP-4R用于擴增RFP。PCR反應體系：共30μL，10×Buffer 3μL，EX Taq酶1 U（0.2 μL），dNTP(Mg2+)1μL，模板DNA 2μL，ddH2O 22 μL，引物R 1μL，引物L 1μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55℃ 40 s，72 ℃ 2 min，擴增35個循環(huán)；最后72 ℃ 20 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。按DNA膠回收純化試劑盒操作說明進行PCR產(chǎn)物的純化。

1.2.3 SOD調(diào)控序列和報告基因RFP的連接：分別將上述PCR產(chǎn)物SODA、SODB、SODC和相應RFP純化回收后等摩爾混合，作為擴增的模板，分別以SODARFP-1L和SOD-RFP-4R，SODB-RFP-1L和SOD-RFP-4R，SODC-RFP-1L和SOD-RFP-4R為引物，反應體系和條件均和前面的相同。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，按DNA膠回收純化試劑盒操作說明進行PCR產(chǎn)物的純化。所得產(chǎn)物即：SODA-RFP、SODB-RFP、SODC-RFP融合基因。

1.2.4 重組產(chǎn)物與pMD18-T載體的連接及轉化：以SOD-RFP的融合基因為control insert，參照TaKaRa pMD18-T Simple Vector 的使用說明書進行。將連接產(chǎn)物轉入BL21感受態(tài)細胞。

1.2.5 SOD-RFP重組子的篩選、鑒定：菌落PCR鑒定：單個菌落的轉化子在200 mL LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)1 h，然后直接進行PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測。低溫誘導鑒定：挑取菌落PCR陽性的白色菌落，用接種針點種至加入Amp的普通LB平板中，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，放入4 ℃冰箱中低溫誘導，觀察是否有肉眼可見紅色的菌落。將紅色菌落涂片后，在激光共聚焦顯微鏡558 nm激發(fā)光下，觀察紅色熒光?；驕y序鑒定：將低溫誘導發(fā)紅的菌種劃板保存，并送至上海桑尼生物科技有限公司進行基因測序鑒定。

1.2.6 Cd2+誘導pMD18-T-SOD-RFP在宿主大腸桿菌BL21中表達：參考文獻[5]，取50 mL LB液體培養(yǎng)基加入50 mL的100 mg/mL Amp+，并接種陽性克隆菌，置于37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)12 h（過夜）后，以1:25的比例分別接種到含Cd2+濃度為0.03、0.3、3.0 mg/mL的培養(yǎng)基中，全溫振蕩培養(yǎng)箱200 r/min，37 ℃培養(yǎng)，并于2、5、10、22、28、34、46、52 h八個時間點檢測生長曲線OD值以及熒光發(fā)光強度。

2 結果

2.1 SODA、SODB、SODC及RFP片段的擴增 分別以SODA-RFP-1L和SODA-RFP-2R，SODB-RFP-1L和SODB-RFP-2R，SODC-RFP-1L和SODC-RFP-2R以及SODRFP-3L和SOD-RFP-4R為引物從含RFP基因的大腸桿菌BL21基因組DNA中分別進行擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳得到長度分別約為300、200、150、600 bp的條帶（見圖1），與預期SODA 284 bp、SODB 150 bp、SODC 165 bp、RFP 605 bp大小基本相符。

圖1 SOD調(diào)控序列基因及RFP基因PCR產(chǎn)物電泳結果

圖2 SOD-RFP PCR產(chǎn)物結果

2.2 重組擴增SOD-RFP融合基因 以第一輪PCR產(chǎn)物純化回收片段為模板，分別以SOD-RFP-1L和SODRFP-4R為引物進行擴增，瓊脂糖電泳得到大小約為900、800、750 bp的條帶（見圖2），與預期SODARFP 889 bp、SODB-RFP 755 bp、SODC-RFP 770 bp大小基本相符。

2.3 T-A克隆重組產(chǎn)物的鑒定 將融合基因SODRFP擴增純化產(chǎn)物與pMD-18 T載體連接后，轉化入BL21感受態(tài)細胞，取白色單菌落，進行菌落PCR和低溫誘導鑒定鑒定，結果表明重組載體中已插入融合基因SOD-RFP（見圖3），挑取經(jīng)低溫誘導出現(xiàn)紅色的菌落，涂片后，激光共聚焦顯微鏡558 nm激發(fā)光檢測（×200），可以觀察到明顯的紅色熒光（見圖4）。從圖4中可以知道，熒光表達強度以SODA為調(diào)控序列的最強，而以SODC為調(diào)控序列的最弱。

圖3 菌落PCR鑒定

圖4 以SODA（A）、SODB（B）、SODC（C）為調(diào)控序列分別在BL21 E.coli中表達紅色熒光蛋白的情況

2.4 基因測序鑒定 將轉入SODA-RFP、SODB-RFP、SODC-RFP的大腸桿菌送交上海桑尼生物科技有限公司，對其質(zhì)粒DNA進行序列測定。測序結果通過在線BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）和chromas軟件進行序列分析，同源性為100%。

2.5 RFP誘導表達 分別用濃度為0.03、0.3、3.0 mg/mL的Cd2+及不加Cd2+相當量的純凈水進行誘導，并于2、5、10、22、28、34、46、52 h八個時間點檢測生長曲線OD值以及熒光發(fā)光強度，以單位熒光強度（熒光強度與吸光度比值）為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，在室溫靜息狀態(tài)下，可見微弱的紅色熒光，經(jīng)Cd2+誘導后，紅色熒光亮度明顯增強，其中0.03、0.3 mg/mL作用下SODA調(diào)控序列驅動的RFP表達最為明顯，3.0 mg/mL作用下，3種SOD驅動的RFP表達全部受抑制（見圖5）。

圖5 SODA/B/C-RFP在4種不同Cd2+濃度下的單位菌量熒光強度

3 討論

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展和人們生活水平的提高，人工合成化學物質(zhì)的種類及用量急劇增加，農(nóng)藥、化肥、重金屬、工業(yè)廢水、生活垃圾等大量排入環(huán)境，對環(huán)境造成了嚴重污染[6-10]。惡劣環(huán)境的脅迫往往使自然界的生物體機體內(nèi)活性氧代謝失衡，產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基，使機體內(nèi)的酶失活，進而影響生物體生長。SOD作為生物機體防御過氧化損傷系統(tǒng)的關鍵酶之一，在真核及原核細胞中廣泛存在分布，它對于清除氧自由基，防止氧自由基破壞細胞的組成、結構和功能，保護細胞免受氧化損傷具有十分重要的作用。

RFP是人們從珊瑚蟲中克隆的一種與綠色熒光蛋白（GFP）同源的熒光蛋白。它無需底物存在，可在558 nm激發(fā)光下發(fā)射紅光，具有靈敏度高、耐受多種苛刻環(huán)境條件等特點[11-12]。它作為一種新興的、具有重要意義的分子標記，已經(jīng)被廣泛應用于生物傳感器、生物發(fā)光材料和光化學等領域，有著巨大的應用價值[13]。我們以RFP作為報告基因，通過觀察紅色熒光強度來反映體內(nèi)SOD的活性，了解三種SOD調(diào)控序列對RFP的調(diào)控作用。

本實驗將含啟動子和操縱子的Cu/ZnSOD、FeSOD、MnSOD基因調(diào)控序列與RFP報告基因通過重組PCR技術[14]進行融合，構建了一個有效地報告基因載體，較之傳統(tǒng)的DNA重組技術，重組PCR不僅克服了小片段回收困難的問題，而且使重組體的形成過程完全不依賴于限制性內(nèi)切酶和連接酶，大大簡化了片段連接過程，從根本上擺脫了DNA 片段內(nèi)部酶切位點的束縛。

構建的三種SOD-RFP融合基因在室溫靜息狀態(tài)下有微弱的紅色熒光，經(jīng)不同濃度重金屬鎘誘導后，熒光強度均明顯增加，表明其總SOD變化趨勢與段學軍等[5]的研究結果相符。本實驗證實，SOD活性的變化主要是由SODA的表達變化引起的，SODA作為調(diào)控序列對后續(xù)報告基因的調(diào)控作用更加明顯。該報告基因載體的成功構建，為研究SOD的基因表達調(diào)控機制提供重要的基礎和工具。

目前，環(huán)境污染物的測定主要有理化分析方法和生物學方法[15]。利用SOD啟動子的這種誘導性表達性能，通過對紅色熒光強度的檢測，我們能夠把構建的報告基因載體轉入大腸桿菌作為檢測水體環(huán)境中刺激因子的微生物傳感器，對重金屬、可溶性有機物等污染物進行初篩。由于實驗材料價廉易得，不需要昂貴的儀器設備和復雜的實驗手段，簡單快速，易操作，成本低，更易在欠發(fā)達地區(qū)或基層檢測機構進行。

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Construction and functional identification of red fluorescent protein reporter gene vector driven by different SOD regulatory sequence inE.coli

WENG Congcong*，F(xiàn)ANG Yimin，HUANG

Runqiao，LIN Dongdong，ZHANG Hongqin，SHI Mengru.﹡
*Biology Department of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To construct red fluorescent protein(RFP)reporter gene vectors driven by different SOD regulatory sequence inE.colithrough fusing MnSOD，F(xiàn)eSOD，Cu/ZnSOD regulatory sequence and RFP gene in BL21E.coli.Methods:Red fluorescent protein(RFP)reporter gene and MnSOD，F(xiàn)eSOD，Cu/ZnSOD regulatory sequence were fused using recombinant PCR technology. And then the SOD-RFP genes connected with pMD18-T plasmid were transfered intoE.coli. The RFP expressed after stimulated by different concentrations Cd2+respectively.Results:Three SOD-RFP fusion genes were correctly constructed，which were proved by DNA sequencing；the reporter gene expressed a little of red flouresecent protein in the resting state at room temperature，but more red flouresecent intensity was obviously increased after Cd2+induction and SODA regulatory sequence was the most obviously RFP expression driven.Conclusion:The red fluorescent protein reporter gene vetors driven by different SOD regulatory sequence inE.colihave been constructed successfully with a sensitive response to Cd2+stimulation. This system provides an important basis and convenient tool for the further study of the regulatory mechanism of SOD gene expression and development of microbial sensor to detect the environmental pollutants.

superoxide dismutase；regulatory sequence；recombinant PCR；red fluorescent protein；reporter gene；E.coli

Q78

A

1000-2138（2012）01-0048-05

2011-05-03

翁叢叢（1988-），女，浙江瑞安人，本科生。

指導老師：施孟如，實驗師，Email：dreamlike007@163.com。

丁敏嬌）

·高教研究·