張麗紅，王 昕，樸姍善，鄭 麗，楊貞耐，*

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130024;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技東北創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林長(zhǎng)春130033)

微小毛霉發(fā)酵制取凝乳酶的培養(yǎng)基優(yōu)化研究

張麗紅1，2，王 昕1，樸姍善1，鄭 麗1，2，楊貞耐1，2，*

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130024;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技東北創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林長(zhǎng)春130033)

利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化微小毛霉的發(fā)酵培養(yǎng)基，提高微小毛霉凝乳酶的凝乳活力。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用Design－Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，建立了3種因素與凝乳酶活力之間的函數(shù)關(guān)系，得出在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入的氯化鈣、乳清粉和葡萄糖的最佳濃度分別為0.58%、0.64%和1.13%，此時(shí)，微小毛霉凝乳酶的凝乳活力的理論值為1150.81SU/mL，驗(yàn)證平均值為1109.7SU/mL，與預(yù)測(cè)值基本一致。

凝乳酶，微小毛霉，發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化

凝乳酶是天冬氨酸蛋白酶的一種［1］，通過剪切Phe105－Met106連接的к－酪蛋白使牛奶凝集，并為排除乳清提供條件［2－3］，同時(shí)對(duì)干酪的質(zhì)構(gòu)形成及干酪特有風(fēng)味的形成有非常重要的作用。目前，干酪生產(chǎn)中應(yīng)用的酶主要來(lái)源于動(dòng)物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。動(dòng)物凝乳酶以其凝乳活力與蛋白水解能力的高比值而成為制作奶酪的首選酶［4］，但隨著世界范圍內(nèi)干酪產(chǎn)量的巨增，全球每年約需屠宰5000萬(wàn)頭小牛，這導(dǎo)致世界范圍內(nèi)凝乳酶供應(yīng)缺乏［5］。微生物具有生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量大、受氣候、地域、時(shí)間限制小且用其生產(chǎn)凝乳酶成本較低、酶提取方便、經(jīng)濟(jì)效益高［6］等特點(diǎn)，因此，為緩和凝乳酶供不應(yīng)求的現(xiàn)狀，在微生物中尋找合適的凝乳酶替代酶成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。常用產(chǎn)凝乳酶的微生物有微小毛霉、粟疫菌、米黑毛霉、易脆毛霉、少根根霉、卷枝毛霉、東京根霉、米曲霉和爪畦根霉等［7－10］，應(yīng)用最多的是根霉及微小毛霉。根霉產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力約為 72～92SU/mL［9－10］，活力較低，毛霉產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力可達(dá)到 600～800SU/mL［11］，其中微小毛霉凝乳酶的蛋白水解活力比皺胃酶強(qiáng)，其蛋白水解能力相對(duì)較弱，對(duì)牛乳的凝固力也強(qiáng)，此外它還具有安全、無(wú)毒、活力高的特點(diǎn)［12－13］，因此，微小毛霉產(chǎn)生的凝乳酶被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面分析法對(duì)微小毛霉的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，提高了微小毛霉凝乳酶的凝乳活力，為篩選產(chǎn)凝乳酶的優(yōu)良菌株提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

微小毛霉(Mucor pusillus)AS3.3345 購(gòu)自中國(guó)普通微生物保藏管理中心。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯去皮，切成塊后稱取200g煮沸30min，然后用紗布過濾，再加葡萄糖和瓊脂 20g，溶化后補(bǔ)足水至 1000mL，121℃滅菌30min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:10g麩皮加10mL水裝于250mL三角瓶中，115℃滅菌20min。

1.3 種子培養(yǎng)和發(fā)酵

從保藏菌種中挑取少量菌絲接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3d，斜面上即長(zhǎng)滿孢子。向生長(zhǎng)良好的斜面上加入10mL無(wú)菌水，洗下孢子，移入裝有玻璃珠和無(wú)菌水的三角瓶中振蕩，使菌體在玻璃珠的攪打下，充分打散，成為單孢子懸液，然后再用無(wú)菌脫脂棉進(jìn)行過濾，調(diào)整孢子數(shù)為106個(gè)/mL，即為種子液。

吸取2mL種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3d，然后加入40mL無(wú)菌水，搗碎培養(yǎng)物，室溫過夜，用無(wú)菌紗布過濾，濾液于8000r/min冷凍離心，棄沉淀，測(cè)定上清液的凝乳酶活力。

1.4 凝乳活性的測(cè)定

取10g脫脂奶粉，用0.01mol/L的CaC12溶液配制成10%的供試乳溶液。此溶液配制后在室溫放置40min后使用，當(dāng)天使用有效。取5mL供試乳溶液，在35℃保溫10min，加入0.5mL適當(dāng)稀釋的待檢樣品溶液(35℃保溫)，迅速混勻，并把試管傾斜45°以上，沿試管軸方向旋轉(zhuǎn)，觀察到管壁上開始出現(xiàn)凝集小顆粒為終點(diǎn)，準(zhǔn)確記錄從酶加入到乳溶液凝固時(shí)間(凝乳時(shí)間一般控制在40～90s)。在上述條件下，40min凝結(jié)1mL脫脂乳的酶量定義為一個(gè)Soxhelt單位(SU)。

酶活力(SU)=(5/0.5)×D×2400/T

式中:D－酶液稀釋倍數(shù);T－凝乳時(shí)間。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)先對(duì)培養(yǎng)基中的碳源、氮源、磷源、鈣源、酵母粉、鎂離子進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明，CaCl2、乳清粉和葡萄糖對(duì)微小毛霉產(chǎn)凝乳酶的影響最大，在基本發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加葡萄糖時(shí)霉菌產(chǎn)酶的活性明顯比添加果糖的高;添加0.8%的乳清粉作為霉菌的碳源有利于菌株產(chǎn)高效的凝乳酶。隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中CaCl2添加量的增加，其產(chǎn)生的凝乳酶活性也逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中CaCl2的添加量為0.5%時(shí)，其產(chǎn)生的凝乳酶活性最大，并且其蛋白水解活性也較低。

1.6 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取了CaCl2、乳清粉和葡萄糖這三個(gè)對(duì)微小毛霉產(chǎn)凝乳酶影響比較大的因素，采用響應(yīng)面分析法對(duì)微小毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的組成進(jìn)行優(yōu)化。以凝乳酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 回歸方程的建立與顯著性分析

對(duì)CaCl2濃度(Z1)、乳清粉濃度(Z2)和葡萄糖濃度(Z3)作如下變換:X1=(Z1－0.5)/0.2，X2=(Z2－0.6)/0.2，X3=(Z3－1)/0.5。以 X1，X2，X3為自變量，以凝乳酶活力為響應(yīng)值(Y)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，氯化鈣濃度、乳清粉濃度和葡萄糖濃度這三個(gè)因素中，氯化鈣濃度對(duì)凝乳酶活力影響最大，其次分別為葡萄糖濃度和乳清粉濃度。方程的相關(guān)系數(shù)為0.9516，說(shuō)明響應(yīng)值(凝乳酶活性)的變化有95.16%來(lái)源于所選變量，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度相關(guān)性。校正相關(guān)系數(shù)為0.8896，說(shuō)明該模型能夠解釋88.96%響應(yīng)值的變化?；貧w方程很好地?cái)M合了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。由模型的P值為0.0008可以看出，模型應(yīng)變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是顯著的。失擬項(xiàng)P值為0.4468，沒有顯著影響，說(shuō)明數(shù)據(jù)中沒有異常點(diǎn)。查F分布表，得F0.01(9，7)=6.72，失擬項(xiàng)F值為2.84小于F0.01(9，7)，方程的 F值為15.33大于F0.01(9，7)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上講該回歸方程具有高度顯著性，證明回歸方程真實(shí)、可靠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上可以認(rèn)為，該方程的擬合度和可信度均較高，可用于代替實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.2 響應(yīng)因子水平的優(yōu)化

為進(jìn)一步直觀地說(shuō)明氯化鈣濃度、乳清粉濃度和葡萄糖濃度之間的交互作用和對(duì)凝乳酶活性的影響，利用Design Expert軟件根據(jù)回歸分析結(jié)果做出相應(yīng)的曲面圖(圖1～圖3)。由3組響應(yīng)面圖的平滑程度可以直觀地看出，氯化鈣的濃度對(duì)微小毛霉凝乳酶的活性影響最顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，葡萄糖次之，乳清粉對(duì)微小毛霉凝乳酶的活性影響最不顯著，表現(xiàn)為曲線較平滑。且由響應(yīng)面立體圖可以看出，X1，X2和X3存在極值點(diǎn)，且最優(yōu)工藝條件為X1=0.58，X2=0.64，X3=1.13，即微小毛霉產(chǎn)凝乳酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件為:氯化鈣濃度0.58%、乳清粉濃度0.64%、葡萄糖濃度1.13%，微小毛霉產(chǎn)凝乳酶的活性的理論值為1150.81SU/mL。

表3 回歸方差分析表

2.3 模擬驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步確定計(jì)算結(jié)果，按最佳條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終的凝乳酶活力分別為 1142.76、1142.86、1043.48SU/mL，平均值為 1109.7SU/mL，與預(yù)測(cè)值(1150.81SU/mL)基本一致，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說(shuō)明響應(yīng)面法適用于對(duì)微小毛霉產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。并且優(yōu)化后所測(cè)得的凝乳酶活力要比單因素實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的凝乳酶活力值高，說(shuō)明可以用此方法對(duì)微小毛霉的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 Y=f(X1，X2)的響應(yīng)面圖

圖2 Y=f(X2，X3)的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

圖3 Y=f(X1，X3)的響應(yīng)面圖

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)微小毛霉的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，提高了微小毛霉凝乳酶的凝乳活力。利用模型的響應(yīng)面對(duì)影響凝乳酶活性的關(guān)鍵因子及其相互作用進(jìn)行探討，優(yōu)化出微小毛霉產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中CaCl2、乳清粉和葡萄糖的最佳濃度分別為0.58%、0.64%和1.13%，在該最佳培養(yǎng)條件下，微小毛霉產(chǎn)凝乳酶的活性的理論值為1150.81SU/mL，驗(yàn)證平均值為1109.7SU/mL，與預(yù)測(cè)值基本一致，證明此模型是合理可靠的，可用于實(shí)際預(yù)測(cè)，為科研工作者進(jìn)一步篩選產(chǎn)凝乳酶的優(yōu)良菌株提供依據(jù)。

［1］Supannee Chitpinityol，M James C.Crabb Chymosin and proteinases［J］.Food Chemisry，1998，6199(4):395－418.

［2］鐘繼才.凝乳酶在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2006，36(1):54－56.

［3］姜峰，張?zhí)m威.我國(guó)凝乳酶特性及其替品的研究現(xiàn)狀［J］.食品研究與開發(fā)，2003，24(6):3－6.

［4］周俊清，林親錄，趙謀明.微生物源凝乳酶的究進(jìn)展［J］.中國(guó)食品添加劑，2004(2):6－9.

［5］Grag A K，Johri B N.Rennet:current trends and futurere seareh［J］.Food Reviews International，1994，10(3):313－355.

［6］錢世鈞，張純青，矯慶華，等.微小毛霉凝乳酶的純化和性質(zhì)［J］.微生物學(xué)報(bào)，1989，29(4):272－277.

［7］張紅梅.凝乳酶的研究進(jìn)展綜述［J］.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2004，25(3).

［8］曾劍超.國(guó)內(nèi)凝乳酶的研究應(yīng)用及其替代品的研究發(fā)展［J］.開發(fā)與研究，2008，25(1):13－16.

［9］韓玲玲，潘道東.根霉產(chǎn)凝乳酶的固態(tài)發(fā)酵條件的研究［J］.食品科學(xué)，2010，31(9):156－160.

［10］葉為標(biāo).根霉產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵條件的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，128(8):53－57.

［11］張娜，郭慶啟，趙新淮.表面毛霉成熟干酪制備工藝優(yōu)化

［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(1):210－212，216.

［12］李玉秋，王景會(huì)，李鐵柱，等.重組微小毛霉凝乳酶的發(fā)酵條件及其酶學(xué)性質(zhì)［J］.食品科學(xué)，2010，31(19):225－230.

［13］Hideyuki K，Kazuo.Rapid and large scale lsolation of chymosin by pepstatin－aminohexy lagarose［J］.Agric Bid Chem，1978，42(2):2227－2231.

Optimization of fermentation medium to producing chymosin by Mucor pusillus

ZHANG Li－h(huán)ong1，2，WANG Xin1，PIAO Shan－shan1，ZHENG Li1，2，YANG Zhen－nai1，2，*

(1.School of Biological and Agricultural Engineering Jilin University，Changchun 130024，China;2.Northeast Agricultural Research Center of China，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China)

Optimization of the medium for fermentation by Mucor pusillus to produce chymosin was carried out by response surface analysis to increase the activity of milk－clotting enzyme(MCE).Based on the single factor test，the polynomial regression analysis was performed on the experimental data by using Design－Expert software and the functional relationship between the three primary components and the MCE activity were built.The optimal values of the factors were obtained:CaCl2was 0.58%，whey powder was 0.64%，glucose was 1.13%.Under the optimized conditions，the theory value of Mucor pusillus MCE activity was 1150.81SU/mL，and the average value tested was 1109.7SU/mL which was similar to the theory value.

chymosin;Mucor pusillus;fermentation medium;optimization

TS201.3

A

1002－0306(2011)09－0214－04

2011－04－22 *通訊聯(lián)系人

張麗紅(1985－)，女，碩士，研究方向:食品科學(xué)。

863現(xiàn)代農(nóng)業(yè)探索導(dǎo)向項(xiàng)目(2006AA10Z306);農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系乳制品加工專項(xiàng)、科學(xué)前沿與交叉學(xué)科創(chuàng)新項(xiàng)目(200903276)。