楊 瑞，翟海瑞，楊勁松

(海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228)

菠蘿皮渣生產(chǎn)蝦青素的發(fā)酵條件研究

楊 瑞，翟海瑞，楊勁松*

(海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228)

以菠蘿皮渣為培養(yǎng)基的主要原料，采用法夫酵母(Phaffia rhodozyma)對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素，采用響應(yīng)面分析法對(duì)法夫酵母的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究。先用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法實(shí)驗(yàn)確定重要因素，再用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)法確定因素水平，最后用響應(yīng)面分析方法求得的最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度為20.0℃，初始pH為5.29，糖度為6.1%，酵母膏2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，種齡36h。用此優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)法夫酵母，蝦青素產(chǎn)量可達(dá)6.5751mg/L。

蝦青素，法夫酵母，菠蘿皮，響應(yīng)面分析法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

法夫酵母(Phaffia rhodozyma) 本研究室保藏并通過(guò)誘變選育獲得;菠蘿皮 從市場(chǎng)取得;菌種保藏培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10、麥芽汁3、蛋白胨5、酵母膏3、瓊脂20，pH5.0;液體種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10、芽汁3、蛋白胨5、酵母膏3，pH5.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 將菠蘿渣沖洗干凈后用榨汁機(jī)壓榨，過(guò)濾，用葡萄糖調(diào)至所需糖度，以上培養(yǎng)基均于121℃滅菌20min;麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，生化試劑;葡萄糖、二甲基亞砜、丙酮 廣州化學(xué)試劑廠，分析純。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

SHZ-95DF全溫振蕩器 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠;UV-1100紫外可見分光光度計(jì) 上海密通機(jī)電科技有限公司;80-2型離心沉淀器 上海手術(shù)器械廠;HSR025型人工氣候箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠; LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器 上海醫(yī)用核子儀器廠;WYT手持糖量計(jì) 成都市青羊聯(lián)合光學(xué)儀器成套部。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)方法 取活化好的菌種接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的 500mL三角瓶中，轉(zhuǎn)速170r/min，溫度21.5℃，培養(yǎng)時(shí)間48h。

1.2.2 發(fā)酵方法 在500mL的三角瓶中裝入50mL培養(yǎng)液，接種量10%，轉(zhuǎn)速170r/min，溫度21.5℃，培養(yǎng)時(shí)間96h。

1.2.3 蝦青素提取及測(cè)定［10］改進(jìn)二甲基亞砜法。發(fā)酵液經(jīng)離心洗滌，加入55℃預(yù)熱的二甲基亞砜溶液5mL，55.0℃水浴15min，再加入4mL丙酮溶液進(jìn)行提取，離心，收集上清液，以二甲基亞砜與丙酮混合液(體積比5∶4)為空白，于480nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清液吸光度。按下式分別計(jì)算單位體積發(fā)酵液的蝦青素產(chǎn)量:

式中:Va為萃取液體積(mL);A480為480nm波長(zhǎng)下的吸光度;E為比消光系數(shù)，取值2150;Vb為發(fā)酵液取樣體積(mL)。

1.2.4 培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.4.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選重要因素

Plackett-Burman是一種兩水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它可以用最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)達(dá)到使因素的主效應(yīng)得到盡可能精確的估計(jì)，從眾多考察因素中快速的篩選出最為重要的幾個(gè)因素，供進(jìn)一步研究用。每個(gè)因素的兩水平分別取低水平與高水平，高水平約低水平的1.25倍。

本實(shí)驗(yàn)以蝦青素的產(chǎn)量作為響應(yīng)值，選擇培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件中的8個(gè)因素作為考察對(duì)象，即糖度、酵母膏、MgSO4、種齡、(NH4)2SO4、初始pH、KH2PO4、發(fā)酵溫度。采用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的Plackett -Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。

1.2.4.2 應(yīng)用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)法確定因素水平 由Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)可知，發(fā)酵溫度、初始pH、糖度這3個(gè)因素對(duì)法夫酵母的生長(zhǎng)有重要的影響，糖度為正效應(yīng)，應(yīng)增加;發(fā)酵溫度和初始pH為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減小。根據(jù)這3個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向及步長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定對(duì)蝦青素產(chǎn)量影響顯著的3個(gè)因素:發(fā)酵溫度、初始pH、糖度。并確定接近最大響應(yīng)值區(qū)域的發(fā)酵溫度、初始pH和糖度的取值。采用中心組合設(shè)計(jì)對(duì)這些因素進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。因素水平選取見表1。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選重要因素

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Minitab15軟件進(jìn)行各因素主效應(yīng)分析，結(jié)果見表2和表3。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)回歸分析表

由表3可知，發(fā)酵溫度、糖度和初始pH是主要的影響因素，其可信度分別為99.6%、95.8%、94.6%。其中糖度為正效應(yīng)，應(yīng)增加;發(fā)酵溫度和初始pH為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減小。其它5個(gè)因素，酵母膏、MgSO4、種齡、(NH4)2SO4、KH2PO4的重要性相對(duì)較小一些，由此確定發(fā)酵溫度、初始pH和糖度為重要因素進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將對(duì)這三個(gè)因素做進(jìn)一步的優(yōu)化。其余各因素的效應(yīng)如下:酵母膏、MgSO4、種齡和(NH4)2SO4正效應(yīng)，取高水平;KH2PO4為負(fù)效應(yīng)，取低水平。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，除上述三個(gè)顯著因素外，其它各因素的水平調(diào)整如下:酵母膏2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，種齡36h，且在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將不再改變。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)回歸分析確定發(fā)酵溫度、初始pH和糖度為重要因素，由此設(shè)計(jì)最速上升實(shí)驗(yàn):減少發(fā)酵溫度、初始pH，分別每次減少2.0℃、0.4，糖度每次增加0.5%，其它因素水平為PB實(shí)驗(yàn)調(diào)整后的值?？疾彀l(fā)酵液蝦青素含量的變化趨勢(shì)，逼進(jìn)最大響應(yīng)區(qū)域。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 最速上升實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4可知，隨發(fā)酵溫度、初始pH的下降和糖度的上升，蝦青素產(chǎn)量變化趨勢(shì)為先上升后下降，3號(hào)發(fā)酵瓶中的色素產(chǎn)量達(dá)到最大值。該處理的發(fā)酵溫度、初始pH和糖度用于下面的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

由Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)選出發(fā)酵溫度、初始pH和糖度為重要因素，進(jìn)而由最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定接近最大響應(yīng)值區(qū)域的發(fā)酵溫度、初始pH和糖度的取值。最后采用響應(yīng)面分析法對(duì)發(fā)酵溫度、初始pH和糖度進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用中心組合設(shè)計(jì)(CCD)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表5 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 回歸方程中回歸系數(shù)的估計(jì)值

表7 回歸方程的方差分析

回歸方程的 R2=0.9337，表明模型能解釋93.37%蝦青素素產(chǎn)量的變化，該模型的擬合效果較好，基本上可以用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。利用軟件可得到其響應(yīng)面分析圖，見圖1～圖3。

圖1 溫度與pH交互作用對(duì)蝦青素產(chǎn)量的影響

圖2 溫度與糖度交互作用對(duì)蝦青素產(chǎn)量的影響

由回歸方程即可計(jì)算得到三個(gè)因素的最佳組合，最終確定培養(yǎng)基優(yōu)化后的最優(yōu)組合為:發(fā)酵溫度為20.0℃，初始pH為5.29，糖度為6.1%，蝦青素預(yù)測(cè)產(chǎn)量Y=6.5925mg/L。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了確定建立的模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否相符，通過(guò)作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)對(duì)模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，以發(fā)酵溫度為20.0℃、初始pH為5.29、糖度為6.1%、酵母膏 2g/L、MgSO42g/L、(NH4)2SO44g/L、KH2PO41.5g/L、種齡36h進(jìn)行重復(fù)搖瓶實(shí)驗(yàn)，蝦青素產(chǎn)量從4.8125mg/L提高到6.5751mg/L。預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間的良好擬合性證實(shí)了模型的有效性。

圖3 pH與糖度交互作用對(duì)蝦青素產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，在法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的過(guò)程中，發(fā)酵溫度、初始pH、糖度對(duì)蝦青素的提高起著重要作用，其參數(shù)分別為發(fā)酵溫度為20.0℃，初始pH為5.29，糖度為6.1%。其他工藝參數(shù)分別為:酵母膏2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，種齡36h;在上述條件下發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素最高值可達(dá)6.5751mg/L，比未優(yōu)化前的產(chǎn)值4.8125mg/L提高了13.7%。

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Fermentation conditions optimization of the astaxanthin production for pineapple peel by Phaffia rhodozyma

YANG Rui，ZHAI Hai-rui，YANG Jin-song*
(College of Food，Hainan University，Haikou 570228，China)

Pineapple peel as main raw material was fermented with Phaffia rhodozyma to produce astaxanthin. Response surface analysis was applied to optimize the fermentation conditions for astaxanthin production.First，used Plackett-Burman design to select the most important fermentation conditions which affecting the growth of Phaffia rhodozyma.Then，the steepest ascent was used to approach region of the fermentation conditions.The optimal fermentation conditions were determined by a central composite design and response surface analysis. And the optimal conditions follows:temperature 20.0℃，initial pH 5.29，sugar content 6.1%，yeast extract 2g/L，MgSO42g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO41.5g/L，seed age 36h.Using the optimal fermentation conditions to culture Phaffia rhodozyma，the yield of astaxanthin could be up to 6.5751mg/L.

astaxanthin;Phaffia rhodozyma;pineapple peel;response surface analysis

TS201.1

B

1002-0306(2011)09-0261-04

蝦青素(Astaxanthin)是一種天然類胡蘿卜素，主要存在于水生動(dòng)物、藻類、酵母、細(xì)菌等生物類群中。在動(dòng)物體內(nèi)，蝦青素具有特殊的著色功能，可以使蝦殼和家禽的表皮及卵黃著色，使其色澤鮮艷［1-2］，最初作為色素而被用作水產(chǎn)業(yè)的餌料添加劑。近幾年的研究表明，蝦青素具有較強(qiáng)的抗氧化、清除自由基、增強(qiáng)宿主免疫力等功能，因此在飼料、食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景［3-4］。法夫酵母是一種產(chǎn)蝦青素的酵母，它具有生長(zhǎng)速度快、發(fā)酵周期短、能利用大多數(shù)糖、可在發(fā)酵罐中實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)等特點(diǎn)，是一種極具產(chǎn)業(yè)化前景的天然類胡蘿卜素資源。但由于原始分離的法夫酵母蝦青素產(chǎn)量水平不高，要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)必須設(shè)法提高產(chǎn)量。楊勁松等對(duì)法夫酵母菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，將蝦青素產(chǎn)量提高到7.26mg/L［5］。朱曉立等通過(guò)對(duì)法夫酵母培養(yǎng)基的優(yōu)化使蝦青素產(chǎn)量達(dá)到15.28mg/L［6］。另外，選用有效、價(jià)廉易得的發(fā)酵底物也是降低成本的一個(gè)重要方面，如以桉樹木水解液［7］、谷物水解物［8］、甘蔗汁［9］為發(fā)酵底物已有報(bào)道。菠蘿果實(shí)加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物—果皮渣，菠蘿皮渣中含有糖分、維生素、微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠?yàn)榉ǚ蚪湍干L(zhǎng)提供一定的營(yíng)養(yǎng)成分。本研究以菠蘿皮渣的汁為主要原料，研究其最優(yōu)培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件，在提高產(chǎn)品附加值的同時(shí)還可以保護(hù)環(huán)境。

2010-08-30 *通訊聯(lián)系人

楊瑞(1984-)，女，在讀碩士，研究方向:食品科學(xué)與工程、應(yīng)用微生物。

國(guó)家科技計(jì)劃支撐項(xiàng)目(2007BAD76B04)。