吉同琴，趙硯榮，魏 佳，劉留成

(江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，江蘇南京211112)

替加環(huán)素(Tigecycline)為甘氨酰環(huán)素類廣譜抗生素，其化學(xué)名為(4S，4aS，5aR，12aS)－9 －［2 －(叔 － 丁氨基)乙酰氨基］－4，7 － 雙(二甲氨基) －1，4，4a，5，5a，6，11，12a－ 八氫－3，10，12，12a－四羥基 －1，11－ 二氧 －2 － 并四苯甲酰胺.替加環(huán)素的作用機制與四環(huán)素類抗生素相似，都是通過與細菌30s核糖體結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)移RNA的進入，使得氨基酸無法結(jié)合成肽鏈，最終起到阻斷細菌蛋白質(zhì)合成，限制細菌生長的作用.不過，替加環(huán)素與核糖體的結(jié)合能力要比四環(huán)素或米諾環(huán)素強5倍.2005年6月16日美國FDA批準注射用替加環(huán)素上市，商品名為Tygacil，規(guī)格為50 mg.批準的適應(yīng)證為用于治療患有復(fù)雜皮膚及軟組織感染以及復(fù)雜的腹腔內(nèi)感染的疾病［1］.本文采用兩種色譜條件測定其有關(guān)物質(zhì)，方法1 參考《美國藥典》30 版及《中國藥典》2010 年版(二部)［2］鹽酸米諾環(huán)素中有關(guān)物質(zhì)檢查項下的色譜條件建立，方法2參照文獻［3］建立，通過對比研究，最后確定了采用方法1，其專屬性強，能準確，快速檢測替加環(huán)素的有關(guān)物質(zhì)，能更好地控制替加環(huán)素的質(zhì)量.

1 儀器與試藥

LC－10AVP型高效液相色譜儀包括LC－10ATVP高壓恒流泵和SPD－10AVP檢測器(日本島津公司);HW－2000色譜工作站(千譜軟件);XS205型分析天平(Metter Toledo);PHS－3C型精密pH計(上海雷磁).

替加環(huán)素(批號:090801、090802、090803)、替加環(huán)素對照品(含量為99.6%，非水滴定法)，均為本單位自制;四氫呋喃、N，N－二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、辛烷磺酸鈉為色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純.

2 溶液的配制

2.1 供試品溶液 取替加環(huán)素約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度，搖勻，即得.

2.2 對照溶液 精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得.

3 色譜條件

3.1 方法1 色譜柱:以辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相:0.2 mol·L－1醋酸銨溶液(含 0.01 mol·L－1乙二胺四乙酸二鈉)－N，N－二甲基甲酰胺－四氫呋喃(67∶29∶4)(用三乙胺調(diào) pH值至7.9);檢測波長:254 nm;流速1 mL·min－1;進樣體積:20 μL.

3.2 方法2 色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相:0.01 mol·L－1磷酸二氫鈉緩沖液(含 0.02 mol·L－1辛烷磺酸鈉及0.5%三乙胺，以磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)－乙腈(75∶25);檢測波長:246 nm;流速 1 mL·min－1;進樣體積:20 μL.

4 方法與結(jié)果

4.1 系統(tǒng)適用性試驗 取供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件測定，典型色譜圖見圖1－1.供試品溶液色譜圖中替加環(huán)素與相鄰峰的分離度為3.4，替加環(huán)素的理論板數(shù)為3 446;取供試品溶液，按“3.2”項下色譜條件測定，典型色譜圖見圖1－2.供試品溶液色譜圖中替加環(huán)素與相鄰峰的分離度為3.3，替加環(huán)素的理論板數(shù)為2 785.

圖1 替加環(huán)素樣品色譜圖 1.替加環(huán)素

4.2 破壞性試驗

4.2.1 強酸破壞 取供試品溶液10 mL，加0.1 mol·L－1鹽酸溶液1 mL，室溫放置2 h，用1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至近中性，用0.45 μm 微孔濾膜濾過.按“3.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2－A－1;按“3.2”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2－A－2.

4.2.2 強堿破壞 取供試品溶液10 mL，加0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液1 mL，室溫放置2 h，用1 mol·L－1鹽酸溶液調(diào)pH值至近中性，用0.45 μm 微孔濾膜濾過.按“3.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2－B－1;按“3.2”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2－B－2.

4.2.3 氧化破壞 取供試品溶液10 mL，加10%過氧化氫溶液1 mL，室溫放置 10 min，用0.45 μm 微孔濾膜濾過.按“3.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2 －C －1;按“3.2”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2－C－2.

4.2.4 高溫破壞 取供試品溶液10 mL，置100℃水浴中加熱 1 h，放冷，用 0.45 μm 微孔濾膜濾過.按“3.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2－D－1;按“3.2”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2－D－2.

4.2.5 強光破壞 取供試品溶液10 mL，置7 500 lx光照強度下照射 2 h，用 0.45 μm 微孔濾膜濾過.按“3.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2－E－1;按“3.2”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2－E－2.

圖2 破壞性試驗樣品色譜圖

試驗結(jié)果表明，本品在強酸、強堿、氧化、高溫、光照等劇烈條件下均有不同程度的破壞，兩個色譜條件均能檢測在替加環(huán)素峰前后產(chǎn)生的數(shù)個降解產(chǎn)物峰，各降解產(chǎn)物峰與替加環(huán)素峰分離良好.

4.3 線性關(guān)系考察 取替加環(huán)素對照品48.56 mg，置50 mL量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度，精密量取5mL，置50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，再分別精密量取0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 mL，置 5 個 10 mL 量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻.取上述溶液，按“3.1”項下色譜條件測定.以替加環(huán)素溶液濃度(X)為橫坐標，對應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程為:Y=879.46X+25.634，r=0.999 9結(jié)果表明，替加環(huán)素溶液濃度在0.49 ～19.42 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好.

4.4 精密度試驗 取4.856 μg·mL－1對照品溶液，按“3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，替加環(huán)素峰面積的RSD為0.49%，結(jié)果表明，本法精密度良好.

4.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液兩份，分別置于25℃和4℃環(huán)境中保存，按“3.1”項下色譜條件，分別于 0、1、2、3、4、5 h進樣測定.結(jié)果表明，供試品溶液在室溫條件下放置，雜質(zhì)峰面積隨著時間的增加而增加;在冷藏條件下3 h內(nèi)有關(guān)物質(zhì)無明顯變化.說明該溶液不穩(wěn)定，配制后應(yīng)立即進樣，必要時冷藏保存，不宜超過3 h.

4.6 檢測限試驗 取對照溶液，用流動相逐級稀釋，以3倍信噪比計算檢測限，按“3.1”項下色譜條件測定，替加環(huán)素的最低檢測限為1.19 ng;按“3.2”項下色譜條件測定，替加環(huán)素的最低檢測限為1.68 ng.

4.7 有關(guān)物質(zhì)測定 精密量取供試品溶液、對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至替加環(huán)素峰保留時間的2.5倍.供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰的峰面積和，并與對照溶液主成分的峰面積比較，用自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)的量，兩種方法的測定結(jié)果見表1.

表1 替加環(huán)素有關(guān)物質(zhì)的測定結(jié)果

5 討論

5.1 檢測波長的選擇 稱取替加環(huán)素適量，加流動相溶解并稀釋制成15 μg·mL－1的溶液，經(jīng)紫外分光光度計的掃描，替加環(huán)素于“3.1”項下的流動相中在254 nm和360 nm的波長處有最大吸收，結(jié)果見圖3;通過HPLC雙波長測定，兩波長條件下，色譜峰個數(shù)相同，但在254 nm的波長下，替加環(huán)素以及有關(guān)物質(zhì)的響應(yīng)值較大，因此，選擇254 nm作為檢測波長.

5.2 起始原料及中間體與替加環(huán)素的分離度考察 稱取9－氨基米諾環(huán)素鹽酸鹽(起始原料)、N－氯乙?；?－氨基米諾環(huán)素(中間體)適量，分別加流動相溶解并稀釋成適宜濃度，按“3.1”項下色譜條件測定.再配制兩者混合后加入替加環(huán)素的溶液，結(jié)果表明，起始原料、中間體均與替加環(huán)素峰分離度良好

圖3 替加環(huán)素紫外吸收光譜圖

5.3 流動相pH的選擇 按“3.1”項下的流動相，調(diào)節(jié)pH值至7.8～8.0范圍內(nèi)，各雜質(zhì)與替加環(huán)素峰均可以達到良好的分離效果.

5.4 小結(jié) 經(jīng)過一系列方法學(xué)比較與驗證，采用本文中“3.1”項下的色譜條件，各雜質(zhì)峰與替加環(huán)素峰分離度良好，能準確地檢測替加環(huán)素的有關(guān)物質(zhì)，可用于替加環(huán)素的質(zhì)量控制.

［1］Pankey GA.Tigecycline［J］.J Antimicrob Chemother，2005，56(3):470 －480.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:697 －698.

［3］Li C，Sutherland CA，Nightingale CH，et al.Quantitation of tigecyline，a novel glycyclcycline［corrected］，by liquid chromatography［J］.J chromatogr B Analyt Techol Biomed Life Sci，2004，811(2):225 －229.