曾俊濤，陳 靜，曾仕平，鐘良寶

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，?？?570102)

研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型乙型肝炎病毒(HBV)與感染后臨床疾病譜有一定的相關(guān)性。迄今為止，海南漢族人群 HBV基因型與前 C區(qū)和 BCP區(qū)基因突變的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究通過(guò)對(duì)慢性乙型肝炎(CHB)患者 HBV基因型和基因序列的檢測(cè)，探討海南漢族 HBV基因型與前 C區(qū) G1896A和BCP區(qū) A1762T/G1764A基因突變之間的相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2005年 2月 ～2006年 10月海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診和住院 CHB患者 83例，男 48例、女 35例，年齡 21～58(37.55±9.68)歲。患者診斷均符合 2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除了其他嗜肝病毒和艾滋病病毒的感染?；颊哐?HBV DNA檢測(cè)均為陽(yáng)性，入組前均未接受抗病毒治療。

1.2 HBV基因型檢測(cè) 采空腹靜脈血，分離血清，凍存于 -20℃待檢。按照HBV基因分型試劑盒(廣州華銀生物有限公司)說(shuō)明書的要求，RT-PCR方法檢測(cè)患者的 HBV基因型。從 50μl血清中提取 HBV DNA，取 B、C、D型反應(yīng)液各 23 μl，分別加入 1 U Taq酶和 2μl模板來(lái)配制反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件:94℃ 60 s，94℃5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。熒光素設(shè)定為 6-羧基熒光素。在反應(yīng)程序的第 2步 60℃末讀取熒光值，樣本在哪一型反應(yīng)液中有擴(kuò)增即為該型;如果在多型反應(yīng)液中都有擴(kuò)增，判為混合感染[1，2]。

1.3 HBV前 C區(qū)和 BCP區(qū)基因突變的檢測(cè) HBV DNA的提取采用北京 Tiangen生物有限公司 DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作要求自200μl血清中提取 HBV DNA作為 PCR模板。PCR擴(kuò)增上游引物為 5'-CCCAAGGTCTTACATAAGAGG-3'，下游引物為5'-GGTGGCCAGATTCATCAACT-3，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為470 bp，包括 C啟動(dòng)區(qū)、前 C區(qū)和部分 X基因。 PCR的反應(yīng)條件:首先 94℃預(yù)變性 120 s;然后 94℃變性60 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 600 s。取 5μl PCR產(chǎn)物，經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR反應(yīng)效果。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，送由中國(guó)國(guó)家人類基因組南方研究中心檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，不同組之間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。HBV基因型、BCP區(qū)和前 C區(qū)基因突變?cè)诓煌M之間分布比較采用 χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV C區(qū)基因 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 采用 PCR擴(kuò)增 HBV C基因核苷酸(nt1643-nt2112)。預(yù)期片段長(zhǎng)度為 470 bp，包括 C啟動(dòng)子、前 C區(qū)及部分 X基因。擴(kuò)增片段陽(yáng)性者可在 470 bp處見(jiàn)到熒光條帶。

2.2 HBV BCP區(qū) A1762T/G1764A、HBV前 C區(qū)G1896A突變基因測(cè)序結(jié)果 見(jiàn)圖1、圖 2。

圖1 BCP區(qū) A1762T/G1764A基因突變

圖2 前 C區(qū) 1896G→A突變基因

2.3 不同基因型與BCP區(qū)A1762T/G1764A和前C區(qū) G1896A突變的關(guān)系 34例基因型 C BCP區(qū)A1762T/G1764A突變率(58.82%)顯著高于基因型B(10.53%)(χ2=18.36，P＜0.05)。基因型 C G1896A突變率為 29.41%，基因型 B G1896A突變率為 47.37%，兩者之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=2.43，P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 83例漢族CHB患者基因型與 BCP區(qū)A 1762T/G1764A和前 C區(qū)G 1896A突變的關(guān)系[例(%)]

3 討論

研究顯示，不同基因型 HBV在致病性方面存在一定差異[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道[4]，基因型 C與較高的HBV DNA水平有關(guān)。Lindh等[5]研究也顯示，與基因型 B比較，基因型 C更易引起嚴(yán)重的肝臟疾病，且與肝臟組織炎癥壞死、纖維化關(guān)系密切。

BCP區(qū)有 3個(gè) AT富集區(qū)，分別位于 nt1752-1755(ATTA)，nt1758-1762(TTAAA)，nt1789-1795(ATAAATT)。BCP區(qū)變異最常見(jiàn)在 1762位核苷酸A→T和 1764位核苷酸 G→A，稱為雙位點(diǎn)突變。本研究顯示，基因型 C BCP區(qū) A1762T/G1764A突變率顯著高于基因型 B。我們推測(cè) BCP區(qū) A1762T/G1764A突變可能是影響基因型 C和基因型 B HBV致病力差異的原因之一。BCP區(qū) A1762T/G1764A雙突變可能通過(guò)以下機(jī)理影響 HBV致病性:①突變使 HBV的轉(zhuǎn)錄和包裝增加，加強(qiáng)病毒復(fù)制;②突變?cè)鰪?qiáng) HBV DNA與肝細(xì)胞 DNA的整合;③BCP區(qū)A1762T/G1764A雙突變可減少 HBeAg的表達(dá)，引發(fā)針對(duì) HBcAg的抗體反應(yīng)，加劇細(xì)胞壞死和損傷;④BCP區(qū) A1762T/G1764A突變使 X基因編碼區(qū)密碼子發(fā)生改變，導(dǎo)致 X蛋白結(jié)構(gòu)異常，從而影響 X蛋白反式激活，導(dǎo)致肝臟組織損害加劇[6]。

HBV前 C區(qū) mRNA翻譯產(chǎn)生一個(gè) 25 kD蛋白，其被信號(hào)肽序列引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，形成 HBeAg的前體蛋白。在目前發(fā)現(xiàn)的前 C區(qū)基因突變位點(diǎn)中，第1896位核苷酸突變最為常見(jiàn)。G1896A的變異可以導(dǎo)致第 28位密碼由色氨酸 TGG突變成終止密碼TAG，終止或減少 HBeAg合成[7，8]。本研究顯示，基因型 C前 C區(qū) G1896A突變率與基因型 B前 C區(qū)G1896A突變率比較無(wú)差異，提示前 C區(qū) G1896A可能與不同基因型 HBV致病力的差異無(wú)關(guān)。

綜上所述，不同基因型 HBV致病能力可能與病毒基因組 BCP區(qū) A1762T/G1764A突變率的不同有關(guān)，而與前 C區(qū) G1896A突變無(wú)關(guān)。

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