丁明亮，歐陽安然，王望斐，顧正華，丁重陽，張 梁，石貴陽

枯草芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

丁明亮，歐陽安然，王望斐，顧正華，丁重陽*，張 梁，石貴陽

(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

為進(jìn)一步提高枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶(milking-clotting enzyme，MCE)的能力，采用單因素試驗和響應(yīng)曲面法對枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究和優(yōu)化。結(jié)果表明：最優(yōu)發(fā)酵工藝為：葡萄糖添加量16.2g/L，在500mL三角瓶中裝53.3mL料液，接種量為體積分?jǐn)?shù)0.130%，發(fā)酵時間120.43h，預(yù)測酶活力為1097.30SU/mL，經(jīng)實驗驗證，在該條件下發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的酶活力為(1129.05±74.55)SU/mL，與模型預(yù)測值相符。

凝乳酶；枯草芽孢桿菌； 液態(tài)發(fā)酵； 響應(yīng)曲面法； 優(yōu)化

凝乳酶是乳酪生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，傳統(tǒng)上利用牛犢第四胃(皺胃)提取制作，隨著乳酪產(chǎn)業(yè)不斷擴(kuò)大，單純靠宰殺幼畜的方法來生產(chǎn)凝乳酶已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代工業(yè)對凝乳酶的需求[1]。20世紀(jì)50年代以來，研究者一直努力尋求新的凝乳酶來源[2]，目前除動物凝乳酶外，還有植物凝乳酶(無花果樹液和菠蘿果實[3])和微生物凝乳酶(主要來源于真菌[4])。微生物的生長特性使得微生物凝乳酶具有廣闊的發(fā)展前景[5]，但關(guān)于微生物凝乳酶的研究主要集中在米黑毛霉(Mucor miehei)和微小毛霉(Mucor pusillus)的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶方面，關(guān)于細(xì)菌液態(tài)發(fā)酵的研究報道較少。細(xì)菌較絲狀真菌，具有生長周期短、生產(chǎn)成本低、易于控制生長條件等優(yōu)點，近幾年得到研究者更多的關(guān)注。

本課題組前期研究篩選得到了1株具有較高產(chǎn)酶能力的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，在此基礎(chǔ)上，本實驗研究影響此株枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的相關(guān)因素，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化并對該條件下發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的酶活力進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 菌種與材料

本實驗室篩選保藏的1株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

脫脂奶粉 黑龍江省光明松鶴乳品有限責(zé)任公司；麩皮由無錫市青山市場購得，并經(jīng)JFSD-100-Ⅱ型粉碎機(jī)(上海嘉定糧儀有限公司，配有30目篩)粉碎。

1.2 培養(yǎng)基、試劑與儀器

斜面種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、酵母膏10、瓊脂條20、pH值自然，115℃滅菌20min；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：麩皮 30、NaCl 5、MgSO4·7H2O 5、KH2PO42、CaCO33、pH值自然，121℃滅菌30min。

氯化鈣、氯化鈉、MgSO4·7H2O、磷酸二氫鉀、碳酸鈣 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DKB-8A型水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DKY-Ⅱ型恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床 上海杜科自動化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

種子液于35℃、150r/min培養(yǎng)24h。發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的培養(yǎng)條件根據(jù)具體實驗設(shè)計改變各參數(shù)的變量。單因素試驗中，葡萄糖質(zhì)量濃度依次采用0、20、40、60g/L；500mL三角瓶中的裝液量依次采用40、60、80、100mL；接種量依次采用0.0125%、0.025%、0.0625%、0.125%；發(fā)酵時間依次采用24、48、72、96、120、144h?；趩我蛩卦囼?，考察發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量、裝液量、接種量和發(fā)酵時間對凝乳酶活力的影響，借助于Design-Expert7.1.6，采用全因子中心組合設(shè)計(Full-factorial CCD)[6]對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合，求得響應(yīng)值與各因子的回歸方程并進(jìn)行實驗驗證。

采用Arima法進(jìn)行凝乳酶活力的測定[7]：用0.01mol/L氯化鈣溶液配制12%脫脂奶粉溶液，室溫放置40min后使用，當(dāng)天配制。取5mL 12%的脫脂奶粉溶液在35℃水浴鍋中保溫10min，加0.05mL酶液，立即搖勻，開始計時，把試管傾斜45°，旋轉(zhuǎn)試管，觀察壁上出現(xiàn)絮狀沉淀時為凝乳終點，記錄凝乳時間。40min凝固1mL脫脂乳的酶量定義為一個索氏單位(Soxhlet unit，SU)。按下式計算凝乳酶活力。

式中：MCE為凝乳酶活力/(SU/mL)；V1為脫脂牛奶溶液體積/mL；t為凝乳時間/s；V2為加酶體積/mL；n為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度對酶活力的影響

圖1 葡萄糖質(zhì)量濃度對凝乳酶活力的影響Fig.1 Effect of glucose on the MCE activity

由圖1可見，葡萄糖質(zhì)量濃度對凝乳酶活力呈現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象：葡萄糖質(zhì)量濃度為0～40g/L時，凝乳酶活力隨葡萄糖質(zhì)量濃度的增加而緩慢升高，當(dāng)葡萄糖添加量為40g/L時酶活力達(dá)最高值402SU/mL；葡萄糖質(zhì)量濃度為40g/L以上時，凝乳酶活力隨葡萄糖質(zhì)量濃度的增加明顯下降。

圖2 裝液量對凝乳酶活力的影響Fig.2 Effect of liquid volume on the MCE activity

2.2 發(fā)酵瓶裝液量對凝乳酶活力的影響該枯草芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵過程對氧有著一定的需求量。由圖2可見，裝液量為60mL/500mL時獲得最高酶活力568SU/mL，再增加裝液量，酶活力會迅速下降，當(dāng)裝液量大于80mL/500mL時，酶活力下降速率減慢，溶氧的減少對產(chǎn)酶不利。

2.3 發(fā)酵接種量對凝乳酶活力的影響

圖3 接種量對凝乳酶活力的影響Fig.3 Effect of inoculums size on the MCE activity

由圖3可見，隨接種量的增加，酶活力不斷增強；接種量在0.0125%～0.025%范圍內(nèi)，酶活力隨接種量的增加迅速上升至673SU/mL；接種量在0.025%～0.0625%范圍內(nèi)，酶活力增加變緩，當(dāng)接種量在0.0625%～0.125%范圍內(nèi)，盡管接種量翻倍，但酶活力基本不變。

2.4 發(fā)酵時間對酶活力的影響

由圖4可見，當(dāng)發(fā)酵時間在24～96h內(nèi)，凝乳酶的活力隨發(fā)酵時間的延長迅速增長，但增加速率逐漸變慢；當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到96h時，酶活力達(dá)到最大值633SU/mL；96h后，酶活力逐漸降低，隨發(fā)酵時間的延長，降低速率逐漸變慢。

圖4 發(fā)酵時間對凝乳酶活力的影響Fig.4 Effect of fermenting time on the MCE activity

2.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化

基于單因素試驗，全因子中心組合試驗考察的因子為發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度、裝液量、接種量和發(fā)酵時間對酶活力的影響，各因子的編碼水平分別由A、B、C、D代表(表1)，其中α=1.68。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，響應(yīng)值為發(fā)酵液中凝乳酶的活力。

表1 全因子中心組合試驗因素水平及編碼表Table 1 Experimental level and code of variables chosen for Fullfactorial CCD

表1中各因素的編碼值與真實值的關(guān)系分別為：A= (X1-40)/2、B=(X2-60)/10、C=(X3-0.125)/0.05、D= (X4-96)/24。

對全因子中心組合設(shè)計的試驗結(jié)果進(jìn)行二次多項式擬合得到響應(yīng)值與各因子的多元回歸方程為：Y=958.83-97.58A-11.89B+20.90C+147.94D-66.09A2-46.989B2-58.4589C2-88.1305D2+46.29AB-3.04AC-28.23AD+ 14.51BC+2.75BD-3.20CD。

表3 回歸方程方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic polynomial model

表2 全因子中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 CCD matrix of the four variables with the experimental and predicted MCE activity

通過分析回歸系數(shù)可知影響發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶活力的各因素的主次順序為發(fā)酵時間＞葡萄糖質(zhì)量濃度＞接種量＞裝液量。對上述方程的方差分析見表3，用F檢驗判定回歸方程的顯著性，該模型P＜0.0001，表明該方程極顯著，其校正決定系數(shù)(R2Adj)為0.9996，說明此模型擬合度較高。根據(jù)模型方程繪制的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖5～10。

圖5 葡萄糖質(zhì)量濃度和裝液量交互影響發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶活力的響應(yīng)曲面圖及其等高線Fig.5 Response surface and their contour plots of MCE activity versus glucose and liquid volume

圖6 葡萄糖質(zhì)量濃度和接種量交互影響發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶活力的響應(yīng)曲面圖及其等高線Fig.6 Response surface and their contour plots of MCE activity versus glucose and inoculum size

圖7 葡萄糖質(zhì)量濃度和發(fā)酵時間交互影響發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶活力的響應(yīng)曲面圖及其等高線Fig.7 Response surface and their contour plots of MCE activity versus glucose and fermenting time

圖8 裝液量和接種量交互影響發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶活力的響應(yīng)曲面圖及其等高線Fig.8 Response surface and their contour plots of MCE activity versus liquid volume and inoculum size

圖9 裝液量和發(fā)酵時間交互影響發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶活力的響應(yīng)曲面圖及其等高線Fig.9 Response surface and their contour plots of MCE activity versus liquid volume and fermenting time

圖10 接種量和發(fā)酵時間交互影響發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶活力的響應(yīng)曲面圖及其等高線Fig.10 Response surface and their contour plots of MCE activity versus inoculum size and fermenting time

由圖5～10可知，葡萄糖質(zhì)量濃度、裝液量、接種量及發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶活力的影響均較為顯著，表現(xiàn)為曲面較陡。通過對模型方程及響應(yīng)面的分析，優(yōu)化得到該菌株發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的最適條件為：葡萄糖質(zhì)量濃度16.2g/L，500mL三角瓶中裝發(fā)酵液53.3mL，接種量0.130%，發(fā)酵時間120.43h，預(yù)測在此條件下酶活力為1097.30SU/mL。經(jīng)實驗驗證在此條件下發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶活力為(1129.05±74.55)SU/mL，與模型預(yù)測值相符。

3 討 論

細(xì)菌具有體積小、繁殖快、發(fā)酵產(chǎn)物易于提取分離等特點，能在人工控制的條件下進(jìn)行生產(chǎn)，如能篩選得到高產(chǎn)凝乳酶的細(xì)菌，則應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)將有很大的潛力[8]?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶可以葡萄糖、果糖[9]、蔗糖[10]為碳源，也有研究指出葡萄糖對于擬諾卡氏屬細(xì)菌(Nocardiopsis sp.)發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶幾乎沒有影響[11]。本菌種在前期實驗中，向培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖和蔗糖，發(fā)酵結(jié)束后添加葡萄糖獲得的最高酶活力比蔗糖的高100SU/mL。單因素試驗中葡萄糖質(zhì)量濃度對凝乳酶活力呈現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象，高質(zhì)量濃度的葡萄糖可能產(chǎn)生鈍化作用或影響到培養(yǎng)基的營養(yǎng)平衡。裝液量直接影響到發(fā)酵過程中發(fā)酵液中溶解氧的濃度。對于好氧發(fā)酵，菌體處于不同的生長階段其需氧量也不同，溶解氧濃度是提高生產(chǎn)能力的關(guān)鍵因素之一[12]。菌體對裝液量的要求反映出發(fā)酵過程中菌體對氧氣的依賴程度，此株枯草芽孢桿菌對溶氧有一定的需求；文獻(xiàn)[12]報道搖瓶中料液體積增加時，體積吸氧速率降低，當(dāng)裝液量超過10%時，料液體積進(jìn)一步增加對于體積吸氧速率無大影響[13]，這與裝液量80～100mL/500mL區(qū)間內(nèi)凝乳酶活力下降速率減慢一致。一般認(rèn)為，接種量過低將延長菌體的遲滯期，導(dǎo)致菌體的生長減慢，發(fā)酵時間延長，而本實驗中發(fā)現(xiàn)接種量極低的情況下利于產(chǎn)酶，是一個值得關(guān)注的現(xiàn)象，目前其具體機(jī)理尚不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。有報道表明，發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的最適發(fā)酵時間為3～8d，因不同菌種而異[10]，本株細(xì)菌產(chǎn)凝乳酶隨發(fā)酵時間先升后降，變化的情況與淀粉絲菌(Amylomyces rouxii)在米湯培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶[14]的情況相似。

鮮有研究將響應(yīng)曲面優(yōu)化應(yīng)用于凝乳酶液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)中，本實驗對一株產(chǎn)凝乳酶能力較強的枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，分析發(fā)現(xiàn)3個單因素變量都是影響凝乳酶活力的關(guān)鍵因素，所得回歸方程極顯著，模型擬合程度較高，預(yù)測酶活力為1097.30SU/mL，實驗驗證得到(1129.05±74.55)SU/mL，與預(yù)測值相符，酶活力較優(yōu)化前有顯著提高。

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Optimizing the Fermentation Process for Milk-clotting Enzyme Production by Bacillus subtilis

DING Ming-liang，OUYANG An-ran，WANG Wang-fei，GU Zheng-hua，DING Zhong-yang*，
ZHANG Liang，SHI Gui-yang
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to improve the yield of milk-clotting enzyme (MCE), response surface methodology (RSM) was used to optimize the fermentation process for the production of milk-clotting enzyme from Bacillus subtilis under liquid fermentation. The results showed that the optimal parameters for the fermenting process were as follows: glucose 16.2 g/L, 53.3 mL medium in a 500 mL Erlenmeyer flask, inoculums size 0.130%, fermenting time 120.43 h, and the predicted MCE yield was 1097.30 SU/mL. Under the optimal conditions the MCE activity was (1129.05 ± 74.55) SU/mL, indicating that the optimizing process is effective.

milk-clotting enzyme；Bacillus subtilis；submerged fermentation；response surface methodology；optimization

Q814.4

A

1002-6630(2011)03-0156-05

2010-04-12

丁明亮(1988—)，男，本科生，研究方向為生物化工。E-mail：dingmingliang0918@163.com

*通信作者：丁重陽(1975—)，男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：zyding@jiangnan.edu.cn