張文龍，張俊生，周麗萍，陳莉華

(吉首大學化學化工學院，湖南 吉首 416000)

氯化血紅素對CdS量子點熒光的猝滅研究及分析應用

張文龍，張俊生，周麗萍，陳莉華*

(吉首大學化學化工學院，湖南 吉首 416000)

以巰基乙酸為穩(wěn)定劑及表面修飾劑，在水溶液中合成了平均粒徑為2.9nm左右的CdS 量子點，該量子點在512.4nm波長處有強的源于表面阱的空穴電子重組形成的表面態(tài)發(fā)射峰，加入的氯化血紅素通過擴散和碰撞作用可將電子轉(zhuǎn)移至CdS 量子點的空穴中導致量子點熒光發(fā)生動態(tài)猝滅，并在此基礎上建立了測定氯化血紅素的新型熒光分析法。在最佳測定條件下，當氯化血紅素的質(zhì)量濃度為5.0×10-6～25.0×10-6g/mL時，體系的相對熒光強度(F)與氯化血紅素的質(zhì)量濃度(ρ)呈線性關系，線性回歸方程為：F=719.09－14.01×10-6ρ，檢出限為3.35×10-8g/mL。測定血清樣品基底中氯化血紅素的含量并獲得滿意結果。

CdS量子點；氯化血紅素；電子轉(zhuǎn)移；熒光猝滅

量子點由于其量子尺寸效應所帶來的特殊光學效應使其在DNA及蛋白質(zhì)標記、活體細胞染色、生物芯片等領域獲得廣泛應用[1]。CdS是其中研究得最深入、應用也最為廣泛的量子點，在探討其作為熒光探針標記蛋白質(zhì)[2]測定牛血清白蛋白[3]及與多肽[4]、半胱氨酸[5]的相互作用時，大多涉及到量子點與生物分子間的能量轉(zhuǎn)移、表面吸附或修飾等作用機理，而對于量子點與生物分子之間的電子轉(zhuǎn)移的研究報道較少。

從動物血中提取出來的氯化血紅素( hemin)作為一種優(yōu)良的天然色素、鐵強化劑及抗貧血藥，廣泛應用于食品、醫(yī)藥和精細化工方面。它既是過氧化物模擬酶也是氧化還原蛋白，對氯化血紅素的分析研究包括其作為過氧化物模擬酶與電極[6]或其他生物分子之間的電子轉(zhuǎn)移[7-8]以及應用分光光度法、熒光分析[9]和化學發(fā)光法等方法對其分析測定，但對于氯化血紅素與量子點特別是CdS量子點在溶液中的熒光行為研究甚少。

本實驗合成了水溶性CdS量子點，使之與氯化血紅素作用，發(fā)現(xiàn)氯化血紅素將猝滅CdS量子點產(chǎn)生的源于表面阱的空穴電子重組形成的表面態(tài)發(fā)射，深入探討了氯化血紅素與量子點之間的猝滅機理，證明了其猝滅機理為電子轉(zhuǎn)移引起的動態(tài)猝滅，并建立了相應的熒光分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

患者的血清從湘西自治州康復醫(yī)院取樣。

Cd(NO3)2蘇州市振興化工廠；硫代乙酰胺、巰基乙酸 湖南師范大學試劑廠；氯化血紅素(溶解于0.01mol/L NaOH溶液，工作液質(zhì)量濃度為100mg/L) 中國科學院上海生物化學研究所；B-R緩沖溶液；高純N2氣；實驗中所用超純水在25℃的電阻率為10～16MΩ·cm，電導率小于0.1μs/cm；其他試劑均為分析純。

RF-5000熒光分光光度計 日本島津公司；JEM3010高倍透射電鏡 日本JEOL電子公司。

1.2 方法

1.2.1 CdS量子點的制備

[10-11]的方法，采用硫代乙酰胺作為反應劑，CdCl2提供鎘源，經(jīng)改進后用下述方法制備CdS量子點。配制40mL 含1.5×10-2mol/L CdCl2及4mL 巰基乙酸的混和溶液，用NaOH調(diào)節(jié)至透明無渾濁，此時pH值約為11左右。通N2除氧約10min，倒入三頸燒瓶內(nèi)，放在恒溫磁力攪拌器中，隔絕空氣條件下緩慢升高溫度，向其中滴加 40mL 1.0×10-2mol/L的硫代乙酰胺溶液([Cd2+]:[S2－]為1.5:1)。將溶液加熱到96℃，在N2保護下攪拌 2.5h，回流3h，過濾，得淡黃色表面富含Cd2+的 CdS量子點溶膠。將該溶膠狀液體與100mL 甲醇超聲攪拌均勻，靜置5h，離心分離大粒徑 CdS，溶液經(jīng)超聲振蕩，得到顆粒較為均勻的 CdS量子點。

1.2.2 巰基乙酸表面修飾CdS量子點

在PBS緩沖液中，將CdS量子點與一定量的巰基乙酸(1:1)，在室溫下于超聲波中振蕩反應6h，取上層可溶功能性量子點備用。

1.2.3 CdS量子點測定氯化血紅素

在15mL 比色管中，準確加入pH值為11. 20的B-R緩沖液2.0mL，0.6mL CdS納米粒子溶液，加入不同質(zhì)量濃度的氯化血紅素溶液(標準曲線)或一定量的樣品溶液(樣品分析)，定容后放置 10min。在 380nm 激發(fā)波長下記錄512.4nm波長處熒光強度 F，CdS量子點溶液的熒光強度為F0，加入氯化血紅素后溶液的熒光強度為F。

2 結果與分析

2.1 電鏡分析

圖1 巰基乙酸透射電鏡(TEM)圖Fig.1 TEM image of CdS-TGA

由圖1可見，所得巰基乙酸修飾的 CdS量子點粒徑均勻，分散性好，可計算粒徑在5 nm以下。

2.2 熒光光譜分析

圖2 氯化血紅素質(zhì)量濃度對CdS熒光光譜的影響Fig.2 Effect of hemin concentration on fluorescence spectra of CdS

由圖2可知，通常CdS有兩種典型的特征發(fā)射峰，一個在520～570nm，另一個在410～490nm。410～490nm的峰是源于晶體本體的激發(fā)態(tài)重組的發(fā)射峰，520～570nm的峰是源于表面阱的空穴電子重組形成的表面態(tài)發(fā)射峰，其中表面態(tài)發(fā)光與納米粒子的生長環(huán)境有關，受周圍介質(zhì)的影響強烈。以波長為380nm的光激發(fā)時，CdS 量子點在512.4nm波長處出現(xiàn)強的熒光峰，半高峰寬(full width at half maximum，F(xiàn)WHM)為49. 8nm，此發(fā)射帶應為表面阱的空穴電子重組形成的表面態(tài)發(fā)射峰。

納米粒子的尺寸D與其熒光峰λe之間有如下關系[12]：D=2.6786×1－4.9348×+3.4222×－1.0511 λe+127.74。

以此計算512.4nm波長處的熒光發(fā)射，可知合成的CdS 量子點粒徑為2.9nm，該粒徑計算結果與高倍透射電鏡(TEM)表征互為佐證。加入氯化血紅素后，體系的熒光峰強度逐漸減弱，最大熒光峰波長不變，說明氯化血紅素的加入使CdS 量子點的熒光發(fā)生猝滅。

2.3 CdS-氯化血紅素體系的吸收光譜

測定了CdS 量子點溶液、氯化血紅素溶液及含等物質(zhì)的量的CdS、氯化血紅素混合溶液的紫外-可見吸收光譜，結果如圖3所示。

圖3 CdS-氯化血紅素體系中各物質(zhì)的吸收光譜圖Fig.3 Absorption spectra of CdS-hemin (1), hemin (2) and CdS (3)

由圖3可知，CdS-氯化血紅素體系的紫外光譜相當于CdS和氯化血紅素紫外光譜的疊加，沒有新的譜峰出現(xiàn)，說明CdS和氯化血紅素沒有結合生成新的物質(zhì)。

2.4 溫度對氯化血紅素猝滅CdS量子點熒光的影響

圖4 溫度對氯化血紅素猝滅CdS熒光強度的影響Fig.4 Effect of temperature on CdS fluorescence quenching by hemin

用ΔF=F0－F為衡量指標，實驗了不同溫度下氯化血紅素猝滅CdS量子點熒光的對應效果，由圖4可知，在35℃時，體系的熒光強度下降最大，其后隨著溫度的上升，體系的ΔF變化不大，5 0℃時，體系的熒光強度下降又減小。因此本實驗選擇測定溫度為35℃。

2.5 pH 值對氯化血紅素猝滅CdS量子點熒光的影響

圖5 pH值對氯化血紅素猝滅CdS熒光強度的影響Fig.5 Effect of pH on CdS fluorescence quenching by hemin

pH值對量子點CdS及CdS-hemin體系的熒光峰位沒有影響，但對相應的熒光強度有較大影響。本體系以B-R緩沖液調(diào)節(jié)溶液的pH值，考察不同pH 值對體系熒光猝滅程度ΔF的影響。由圖5可知，在pH8.66時，體系的ΔF最大，但熒光強度F0較小。在pH 11.20時，熒光強度F0最大，這時ΔF也較大。綜合考慮F0和ΔF的因素，本實驗選擇pH11.20的B-R緩沖溶液調(diào)節(jié)體系的p H值。

2.6 干擾離子對氯化血紅素猝滅CdS量子點熒光的影響

在最佳實驗條件下，按照氨基酸、糖類等主要生命元素實驗共存物質(zhì)對1.0×10-5g/mL氯化血紅素猝滅CdS量子點熒光的影響，結果見表1。

表1 干擾離子對氯化血紅素猝滅CdS量子點熒光的影響Table1 Effects of coexisting ions for CdS fluorescence quenching by hemin

由表1可知，大部分干擾離子沒有干擾。

2.7 基于猝滅CdS量子點熒光的氯化血紅素定量關系

微量氯化血紅素可猝滅CdS量子點熒光，且隨氯化血紅素質(zhì)量濃度增大猝滅程度加劇，基于此，可建立氯化血紅素的分析方法，在選定的最佳條件下繪制標準曲線，在5.0×10-6～25.0×10-6g/mL 范圍內(nèi)，氯化血紅素質(zhì)量濃度(c)與體系相對熒光強度(F)有良好的線性關系，其線性回歸方程為：F=719.09－14.01×10-6ρ(R2= 0.9995)。根據(jù) IUPAC規(guī)定，檢出限按3δ/K(δ為空白多次測得信號的標準偏差，K為方法的靈敏度，即校準曲線的斜率)計算為3.35×10-8g/mL。

2.8 樣品分析

表2 氯化血紅素樣品含量測定結果Table2 Analytical results of hemin in human blood serum

以不同患者的血清作為基底加入氯化血紅素按實驗方法測定含量，表2的結果表明，血清中其他物質(zhì)對氯化血紅素測定沒有干擾，可用于實際樣品分析。

2.9 猝滅機理探討

熒光猝滅過程通常分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，常通過以下辦法來區(qū)分是動態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅：1) 因動態(tài)猝滅依賴于分子間的擴散，升高溫度會加速擴散，因而動態(tài)猝滅常數(shù)應隨溫度升高而增大；但升高溫度將導致配合物的穩(wěn)定性降低，因而靜態(tài)猝滅常數(shù)應隨溫度升高而減??；2)由于動態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，因而并不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜；而靜態(tài)猝滅中，基態(tài)配合物的生成往往會導致熒光物質(zhì)熒光吸收光譜的改變，即最大吸收波長發(fā)生紅移或藍移，或有新的譜峰出現(xiàn)；3)猝滅過程常數(shù)的不同。

下面從上述三方面進行猝滅方式的認定。

1)溫度對猝滅的影響

其他條件不變，分別測定15、25、35、45℃溫度各自的猝滅常數(shù)，結果如圖6和表3所示，由此看出猝滅常數(shù)KSV隨溫度升高而增大，初步判斷反應為動態(tài)猝滅。

圖6 氯化血紅素質(zhì)量濃度對CdS量子點熒光猝滅的Stern-Volmer圖Fig.6 Stern-Volmer curvers of CdS fluorescence quenching by hemin

表3 線性方程和相關系數(shù)Table3 Regression equations and correlation coefficients

2)紫外光譜與熒光光譜分析

作為熒光體的CdS 量子點在512.4nm波長處出現(xiàn)強的熒光峰，在200～450nm之間沒有熒光發(fā)射，作為猝滅劑的氯化血紅素的紫外吸收光譜最大峰出現(xiàn)在350nm和390nm波長處，390nm的吸收峰應是血紅素的Soret 譜帶特征峰。由氯化血紅素的紫外光譜與CdS量子點熒光光譜的擬合圖(圖7)看出，CdS量子點的熒光發(fā)射光譜與氯化血紅素的紫外吸收光譜交疊很少，即熒光體CdS和猝滅劑氯化血紅素之間沒有發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。

圖7 氯化血紅素的紫外光譜與CdS量子點熒光光譜的擬合圖Fig.7 Overlap of hemin absorption spectrum (1) with CdS fluorscence spectrum (2)

3)假如該過程為動態(tài)猝滅過程，則有：Ksv=Kqτ0。式中：Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)；τ0為猝滅劑不存在時熒光體的平均壽命，一般半導體量子點的平均壽命為20～50ns。

假設本實驗合成的巰基乙酸功能化的CdS量子點熒光壽命τ0= 30ns的話，用25℃的KSV值為2.48×104計算，可知其Kq為8.3×1010L/(mol·s)，該值與各類猝滅劑對生物分子的最大碰撞猝滅過程速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)的值均在同一個數(shù)量級，進一步說明氯化血紅素對CdS的猝滅屬于動態(tài)猝滅。

圖8 熒光猝滅機理推測圖Fig.8 Speculative fluorescence quenching mechanism between hemin and CdS

大量研究表明，納米粒子的猝滅機制可以通過能量轉(zhuǎn)移[13]、電荷轉(zhuǎn)移[14]及表面吸附分子[15]對表面態(tài)能級的改變等各種形式而改變整個體系的發(fā)光。對CdS納米粒子來說，400～600nm范圍的熒光發(fā)射光譜與氯化血紅素分子400～600nm范圍的吸收光譜交疊很少，因而可以忽略能量轉(zhuǎn)移機制；氯化血紅素與CdS進行碰撞后，CdS的熒光峰強度下降但最大吸收光譜沒有藍移或紅移，說明沒有發(fā)生表面吸附分子或氯化血紅素取代巰基乙酸使CdS納米粒子的化學環(huán)境和表面態(tài)能級發(fā)生改變，由此推測氯化血紅素通過擴散和碰撞與CdS量子點發(fā)生氧化還原反應而進行電荷轉(zhuǎn)移，氯化血紅素提供的電子躍遷到量子點的空穴中導致CdS量子點的熒光發(fā)生動態(tài)猝滅，其動態(tài)猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大，猝滅效果隨猝滅劑質(zhì)量濃度增大而加強，如圖8所示。

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Fluorescence Quenching Mechanism of CdS Quantum Dots by Hemin and Its Application

ZHANG Wen-long，ZHANGF Jun-sheng，ZHOU Li-ping，CHEN Li-hua*
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)

CdS quantum dots were synthesized in aqueous solution by using mercaptoethylic acid as the stabilizer and surface-modification reagent. The 512.4 nm fluorescence emission which was caused by the cavity-electron recombination on surface trap of CdS quantum dots was quenched in the presence of hemin. The quenching mechanism was a dynamic process based on electron transfer between Fe2+of hemin and cavity of CdS quantum dots. Under optimal conditions, a concentration of 5.0×10-6－25.0×10-6g/mL of hemin could be determined on the basis of the decrease ratio of fluorescence intensity of CdS quantum dots,with a detection limit of 3.35×10-8g/mL. The proposed method was utilized to analyze the blood serum sample in which hemin was added with satisfactory results.

CdS quantum dots；hemin；electron transfer；fluorescence quenching

TS264.4

A

1002-6630(2011)03-0051-05

2010-03-15

湖南省教育廳自科基金重點項目(05A009)；湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室開放課題(2005019)；吉首大學回校博士基金資助項目(JD05001)

張文龍(1987—)，男，碩士研究生，研究方向為納米粒子熒光特性及分析應用。E-mail：wlaoxi@163.com

*通信作者：陳莉華(1961—)，女，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物。E-mail：chenlihua99@163.com