張文龍，張俊生，周麗萍，陳莉華

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

氯化血紅素對(duì)CdS量子點(diǎn)熒光的猝滅研究及分析應(yīng)用

張文龍，張俊生，周麗萍，陳莉華*

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

以巰基乙酸為穩(wěn)定劑及表面修飾劑，在水溶液中合成了平均粒徑為2.9nm左右的CdS 量子點(diǎn)，該量子點(diǎn)在512.4nm波長處有強(qiáng)的源于表面阱的空穴電子重組形成的表面態(tài)發(fā)射峰，加入的氯化血紅素通過擴(kuò)散和碰撞作用可將電子轉(zhuǎn)移至CdS 量子點(diǎn)的空穴中導(dǎo)致量子點(diǎn)熒光發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅，并在此基礎(chǔ)上建立了測(cè)定氯化血紅素的新型熒光分析法。在最佳測(cè)定條件下，當(dāng)氯化血紅素的質(zhì)量濃度為5.0×10-6～25.0×10-6g/mL時(shí)，體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度(F)與氯化血紅素的質(zhì)量濃度(ρ)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為：F=719.09－14.01×10-6ρ，檢出限為3.35×10-8g/mL。測(cè)定血清樣品基底中氯化血紅素的含量并獲得滿意結(jié)果。

CdS量子點(diǎn)；氯化血紅素；電子轉(zhuǎn)移；熒光猝滅

量子點(diǎn)由于其量子尺寸效應(yīng)所帶來的特殊光學(xué)效應(yīng)使其在DNA及蛋白質(zhì)標(biāo)記、活體細(xì)胞染色、生物芯片等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[1]。CdS是其中研究得最深入、應(yīng)用也最為廣泛的量子點(diǎn)，在探討其作為熒光探針標(biāo)記蛋白質(zhì)[2]測(cè)定牛血清白蛋白[3]及與多肽[4]、半胱氨酸[5]的相互作用時(shí)，大多涉及到量子點(diǎn)與生物分子間的能量轉(zhuǎn)移、表面吸附或修飾等作用機(jī)理，而對(duì)于量子點(diǎn)與生物分子之間的電子轉(zhuǎn)移的研究報(bào)道較少。

從動(dòng)物血中提取出來的氯化血紅素( hemin)作為一種優(yōu)良的天然色素、鐵強(qiáng)化劑及抗貧血藥，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和精細(xì)化工方面。它既是過氧化物模擬酶也是氧化還原蛋白，對(duì)氯化血紅素的分析研究包括其作為過氧化物模擬酶與電極[6]或其他生物分子之間的電子轉(zhuǎn)移[7-8]以及應(yīng)用分光光度法、熒光分析[9]和化學(xué)發(fā)光法等方法對(duì)其分析測(cè)定，但對(duì)于氯化血紅素與量子點(diǎn)特別是CdS量子點(diǎn)在溶液中的熒光行為研究甚少。

本實(shí)驗(yàn)合成了水溶性CdS量子點(diǎn)，使之與氯化血紅素作用，發(fā)現(xiàn)氯化血紅素將猝滅CdS量子點(diǎn)產(chǎn)生的源于表面阱的空穴電子重組形成的表面態(tài)發(fā)射，深入探討了氯化血紅素與量子點(diǎn)之間的猝滅機(jī)理，證明了其猝滅機(jī)理為電子轉(zhuǎn)移引起的動(dòng)態(tài)猝滅，并建立了相應(yīng)的熒光分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

患者的血清從湘西自治州康復(fù)醫(yī)院取樣。

Cd(NO3)2蘇州市振興化工廠；硫代乙酰胺、巰基乙酸 湖南師范大學(xué)試劑廠；氯化血紅素(溶解于0.01mol/L NaOH溶液，工作液質(zhì)量濃度為100mg/L) 中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所；B-R緩沖溶液；高純N2氣；實(shí)驗(yàn)中所用超純水在25℃的電阻率為10～16MΩ·cm，電導(dǎo)率小于0.1μs/cm；其他試劑均為分析純。

RF-5000熒光分光光度計(jì) 日本島津公司；JEM3010高倍透射電鏡 日本JEOL電子公司。

1.2 方法

1.2.1 CdS量子點(diǎn)的制備

[10-11]的方法，采用硫代乙酰胺作為反應(yīng)劑，CdCl2提供鎘源，經(jīng)改進(jìn)后用下述方法制備CdS量子點(diǎn)。配制40mL 含1.5×10-2mol/L CdCl2及4mL 巰基乙酸的混和溶液，用NaOH調(diào)節(jié)至透明無渾濁，此時(shí)pH值約為11左右。通N2除氧約10min，倒入三頸燒瓶?jī)?nèi)，放在恒溫磁力攪拌器中，隔絕空氣條件下緩慢升高溫度，向其中滴加 40mL 1.0×10-2mol/L的硫代乙酰胺溶液([Cd2+]:[S2－]為1.5:1)。將溶液加熱到96℃，在N2保護(hù)下攪拌 2.5h，回流3h，過濾，得淡黃色表面富含Cd2+的 CdS量子點(diǎn)溶膠。將該溶膠狀液體與100mL 甲醇超聲攪拌均勻，靜置5h，離心分離大粒徑 CdS，溶液經(jīng)超聲振蕩，得到顆粒較為均勻的 CdS量子點(diǎn)。

1.2.2 巰基乙酸表面修飾CdS量子點(diǎn)

在PBS緩沖液中，將CdS量子點(diǎn)與一定量的巰基乙酸(1:1)，在室溫下于超聲波中振蕩反應(yīng)6h，取上層可溶功能性量子點(diǎn)備用。

1.2.3 CdS量子點(diǎn)測(cè)定氯化血紅素

在15mL 比色管中，準(zhǔn)確加入pH值為11. 20的B-R緩沖液2.0mL，0.6mL CdS納米粒子溶液，加入不同質(zhì)量濃度的氯化血紅素溶液(標(biāo)準(zhǔn)曲線)或一定量的樣品溶液(樣品分析)，定容后放置 10min。在 380nm 激發(fā)波長下記錄512.4nm波長處熒光強(qiáng)度 F，CdS量子點(diǎn)溶液的熒光強(qiáng)度為F0，加入氯化血紅素后溶液的熒光強(qiáng)度為F。

2 結(jié)果與分析

2.1 電鏡分析

圖1 巰基乙酸透射電鏡(TEM)圖Fig.1 TEM image of CdS-TGA

由圖1可見，所得巰基乙酸修飾的 CdS量子點(diǎn)粒徑均勻，分散性好，可計(jì)算粒徑在5 nm以下。

2.2 熒光光譜分析

圖2 氯化血紅素質(zhì)量濃度對(duì)CdS熒光光譜的影響Fig.2 Effect of hemin concentration on fluorescence spectra of CdS

由圖2可知，通常CdS有兩種典型的特征發(fā)射峰，一個(gè)在520～570nm，另一個(gè)在410～490nm。410～490nm的峰是源于晶體本體的激發(fā)態(tài)重組的發(fā)射峰，520～570nm的峰是源于表面阱的空穴電子重組形成的表面態(tài)發(fā)射峰，其中表面態(tài)發(fā)光與納米粒子的生長環(huán)境有關(guān)，受周圍介質(zhì)的影響強(qiáng)烈。以波長為380nm的光激發(fā)時(shí)，CdS 量子點(diǎn)在512.4nm波長處出現(xiàn)強(qiáng)的熒光峰，半高峰寬(full width at half maximum，F(xiàn)WHM)為49. 8nm，此發(fā)射帶應(yīng)為表面阱的空穴電子重組形成的表面態(tài)發(fā)射峰。

納米粒子的尺寸D與其熒光峰λe之間有如下關(guān)系[12]：D=2.6786×1－4.9348×+3.4222×－1.0511 λe+127.74。

以此計(jì)算512.4nm波長處的熒光發(fā)射，可知合成的CdS 量子點(diǎn)粒徑為2.9nm，該粒徑計(jì)算結(jié)果與高倍透射電鏡(TEM)表征互為佐證。加入氯化血紅素后，體系的熒光峰強(qiáng)度逐漸減弱，最大熒光峰波長不變，說明氯化血紅素的加入使CdS 量子點(diǎn)的熒光發(fā)生猝滅。

2.3 CdS-氯化血紅素體系的吸收光譜

測(cè)定了CdS 量子點(diǎn)溶液、氯化血紅素溶液及含等物質(zhì)的量的CdS、氯化血紅素混合溶液的紫外-可見吸收光譜，結(jié)果如圖3所示。

圖3 CdS-氯化血紅素體系中各物質(zhì)的吸收光譜圖Fig.3 Absorption spectra of CdS-hemin (1), hemin (2) and CdS (3)

由圖3可知，CdS-氯化血紅素體系的紫外光譜相當(dāng)于CdS和氯化血紅素紫外光譜的疊加，沒有新的譜峰出現(xiàn)，說明CdS和氯化血紅素沒有結(jié)合生成新的物質(zhì)。

2.4 溫度對(duì)氯化血紅素猝滅CdS量子點(diǎn)熒光的影響

圖4 溫度對(duì)氯化血紅素猝滅CdS熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of temperature on CdS fluorescence quenching by hemin

用ΔF=F0－F為衡量指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)了不同溫度下氯化血紅素猝滅CdS量子點(diǎn)熒光的對(duì)應(yīng)效果，由圖4可知，在35℃時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度下降最大，其后隨著溫度的上升，體系的ΔF變化不大，5 0℃時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度下降又減小。因此本實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定溫度為35℃。

2.5 pH 值對(duì)氯化血紅素猝滅CdS量子點(diǎn)熒光的影響

圖5 pH值對(duì)氯化血紅素猝滅CdS熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of pH on CdS fluorescence quenching by hemin

pH值對(duì)量子點(diǎn)CdS及CdS-hemin體系的熒光峰位沒有影響，但對(duì)相應(yīng)的熒光強(qiáng)度有較大影響。本體系以B-R緩沖液調(diào)節(jié)溶液的pH值，考察不同pH 值對(duì)體系熒光猝滅程度ΔF的影響。由圖5可知，在pH8.66時(shí)，體系的ΔF最大，但熒光強(qiáng)度F0較小。在pH 11.20時(shí)，熒光強(qiáng)度F0最大，這時(shí)ΔF也較大。綜合考慮F0和ΔF的因素，本實(shí)驗(yàn)選擇pH11.20的B-R緩沖溶液調(diào)節(jié)體系的p H值。

2.6 干擾離子對(duì)氯化血紅素猝滅CdS量子點(diǎn)熒光的影響

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，按照氨基酸、糖類等主要生命元素實(shí)驗(yàn)共存物質(zhì)對(duì)1.0×10-5g/mL氯化血紅素猝滅CdS量子點(diǎn)熒光的影響，結(jié)果見表1。

表1 干擾離子對(duì)氯化血紅素猝滅CdS量子點(diǎn)熒光的影響Table1 Effects of coexisting ions for CdS fluorescence quenching by hemin

由表1可知，大部分干擾離子沒有干擾。

2.7 基于猝滅CdS量子點(diǎn)熒光的氯化血紅素定量關(guān)系

微量氯化血紅素可猝滅CdS量子點(diǎn)熒光，且隨氯化血紅素質(zhì)量濃度增大猝滅程度加劇，基于此，可建立氯化血紅素的分析方法，在選定的最佳條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在5.0×10-6～25.0×10-6g/mL 范圍內(nèi)，氯化血紅素質(zhì)量濃度(c)與體系相對(duì)熒光強(qiáng)度(F)有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：F=719.09－14.01×10-6ρ(R2= 0.9995)。根據(jù) IUPAC規(guī)定，檢出限按3δ/K(δ為空白多次測(cè)得信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K為方法的靈敏度，即校準(zhǔn)曲線的斜率)計(jì)算為3.35×10-8g/mL。

2.8 樣品分析

表2 氯化血紅素樣品含量測(cè)定結(jié)果Table2 Analytical results of hemin in human blood serum

以不同患者的血清作為基底加入氯化血紅素按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定含量，表2的結(jié)果表明，血清中其他物質(zhì)對(duì)氯化血紅素測(cè)定沒有干擾，可用于實(shí)際樣品分析。

2.9 猝滅機(jī)理探討

熒光猝滅過程通常分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，常通過以下辦法來區(qū)分是動(dòng)態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅：1) 因動(dòng)態(tài)猝滅依賴于分子間的擴(kuò)散，升高溫度會(huì)加速擴(kuò)散，因而動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)應(yīng)隨溫度升高而增大；但升高溫度將導(dǎo)致配合物的穩(wěn)定性降低，因而靜態(tài)猝滅常數(shù)應(yīng)隨溫度升高而減?。?)由于動(dòng)態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，因而并不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜；而靜態(tài)猝滅中，基態(tài)配合物的生成往往會(huì)導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光吸收光譜的改變，即最大吸收波長發(fā)生紅移或藍(lán)移，或有新的譜峰出現(xiàn)；3)猝滅過程常數(shù)的不同。

下面從上述三方面進(jìn)行猝滅方式的認(rèn)定。

1)溫度對(duì)猝滅的影響

其他條件不變，分別測(cè)定15、25、35、45℃溫度各自的猝滅常數(shù)，結(jié)果如圖6和表3所示，由此看出猝滅常數(shù)KSV隨溫度升高而增大，初步判斷反應(yīng)為動(dòng)態(tài)猝滅。

圖6 氯化血紅素質(zhì)量濃度對(duì)CdS量子點(diǎn)熒光猝滅的Stern-Volmer圖Fig.6 Stern-Volmer curvers of CdS fluorescence quenching by hemin

表3 線性方程和相關(guān)系數(shù)Table3 Regression equations and correlation coefficients

2)紫外光譜與熒光光譜分析

作為熒光體的CdS 量子點(diǎn)在512.4nm波長處出現(xiàn)強(qiáng)的熒光峰，在200～450nm之間沒有熒光發(fā)射，作為猝滅劑的氯化血紅素的紫外吸收光譜最大峰出現(xiàn)在350nm和390nm波長處，390nm的吸收峰應(yīng)是血紅素的Soret 譜帶特征峰。由氯化血紅素的紫外光譜與CdS量子點(diǎn)熒光光譜的擬合圖(圖7)看出，CdS量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜與氯化血紅素的紫外吸收光譜交疊很少，即熒光體CdS和猝滅劑氯化血紅素之間沒有發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。

圖7 氯化血紅素的紫外光譜與CdS量子點(diǎn)熒光光譜的擬合圖Fig.7 Overlap of hemin absorption spectrum (1) with CdS fluorscence spectrum (2)

3)假如該過程為動(dòng)態(tài)猝滅過程，則有：Ksv=Kqτ0。式中：Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)；τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光體的平均壽命，一般半導(dǎo)體量子點(diǎn)的平均壽命為20～50ns。

假設(shè)本實(shí)驗(yàn)合成的巰基乙酸功能化的CdS量子點(diǎn)熒光壽命τ0= 30ns的話，用25℃的KSV值為2.48×104計(jì)算，可知其Kq為8.3×1010L/(mol·s)，該值與各類猝滅劑對(duì)生物分子的最大碰撞猝滅過程速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)的值均在同一個(gè)數(shù)量級(jí)，進(jìn)一步說明氯化血紅素對(duì)CdS的猝滅屬于動(dòng)態(tài)猝滅。

圖8 熒光猝滅機(jī)理推測(cè)圖Fig.8 Speculative fluorescence quenching mechanism between hemin and CdS

大量研究表明，納米粒子的猝滅機(jī)制可以通過能量轉(zhuǎn)移[13]、電荷轉(zhuǎn)移[14]及表面吸附分子[15]對(duì)表面態(tài)能級(jí)的改變等各種形式而改變整個(gè)體系的發(fā)光。對(duì)CdS納米粒子來說，400～600nm范圍的熒光發(fā)射光譜與氯化血紅素分子400～600nm范圍的吸收光譜交疊很少，因而可以忽略能量轉(zhuǎn)移機(jī)制；氯化血紅素與CdS進(jìn)行碰撞后，CdS的熒光峰強(qiáng)度下降但最大吸收光譜沒有藍(lán)移或紅移，說明沒有發(fā)生表面吸附分子或氯化血紅素取代巰基乙酸使CdS納米粒子的化學(xué)環(huán)境和表面態(tài)能級(jí)發(fā)生改變，由此推測(cè)氯化血紅素通過擴(kuò)散和碰撞與CdS量子點(diǎn)發(fā)生氧化還原反應(yīng)而進(jìn)行電荷轉(zhuǎn)移，氯化血紅素提供的電子躍遷到量子點(diǎn)的空穴中導(dǎo)致CdS量子點(diǎn)的熒光發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅，其動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大，猝滅效果隨猝滅劑質(zhì)量濃度增大而加強(qiáng)，如圖8所示。

參考文獻(xiàn)：

[1] XU Huan, WU Jien, CHEN Chihhsin, et al. Detecting hydrogen sulfide by using transparent polymer with embedded CdSe/CdS quantum dots[J].Sensors and Actuators B: Chemical, 2010, 143(2): 535-538.

[2] 曾慶輝, 張友林, 杜創(chuàng), 等. CdTe/CdS核殼量子點(diǎn)與蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2009, 30(6): 1158-1161.

[3] 陳紅旗, 梁阿妮, 許軼, 等. CdS/PPA納米溶膠熒光探針同步熒光光度法測(cè)定水溶液中牛血清白蛋白[J]. 應(yīng)用化學(xué), 2008, 25(12): 1484-1486.

[4] 陳旭東, 王新波, 范莉, 等. CdS納米晶與多肽相互作用研究[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 63(17): 1600-1606.

[5] 劉輝, 李文友, 尹洪宗, 等. CdS納米粒子與半胱氨酸相互作用的研究[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 26 (9):1618-1622.

[6] BRUSOVA Z, MAGNER E. Kinetics of oxidation of hydrogen peroxide at hemin-modified electrodes in nonaqueous solvents[J].Bioelectrochemistry, 2009, 76(1): 63-69.

[7] ZHANG Yafen, YAN Rui, ZHAO Faqiong, et al. Polyvinyl alcoholionic liquid composition for promoting the direct electron transfer and electrocatalysis of hemoglobin[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,2009, 71(2): 288-292.

[8] REEDER B J, CUTRUZZOLA F, BIGOTTI M G, et al. Tyrosine as a redox-active center in electron transfer to ferryl heme in globins[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2008, 44 (3): 274-283.

[9] SANTOS W, LIMA PR, TARLEY C R T, et al. Synthesis and application of a peroxidase-like molecularly imprinted polymer based on hemin for selective determination of serotonin in blood serum[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 631(2): 170-176.

[10] UNNI C, PHILIP D, SMITHA S L, et al. Aqueous synthesis and characterization of CdS, CdS:Zn2+and CdS:Cu2+quantum dots[J].Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2009, 72(4): 827-832.

[11] ZHANG Laijun, SHEN Xingcan, LIANG Hong, et al. Hot-injection synthesis of highly luminescent and monodisperse CdS nanocrystals using thioacetamide and cadmium source with proper reactivity[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2010, 342(2): 236-242.

[12] WU D G, MARTIN E K, van PATTEN P G. A new class of capping ligands for CdSe nanocrystal synthesis[J]. Chem Mater, 2005, 17: 6436-6441.

[13] 吳峰, 蔡繼業(yè). 基于量子點(diǎn)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的應(yīng)用[J]. 化學(xué)與生物工程, 2007, 24(1): 58-61.

[14] 莊嚴(yán), 周全法. 納米粒子與吸附分子之間電荷轉(zhuǎn)移的影響因素研究[J]. 稀有金屬材料與工程, 2008, 37(4): 637-640.

[15] 陳莉華, 覃事棟, 李朝陽. 胃蛋白酶對(duì)CdTe納米粒子的表面修飾及分析應(yīng)用[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29 (2): 277-282.

Fluorescence Quenching Mechanism of CdS Quantum Dots by Hemin and Its Application

ZHANG Wen-long，ZHANGF Jun-sheng，ZHOU Li-ping，CHEN Li-hua*
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)

CdS quantum dots were synthesized in aqueous solution by using mercaptoethylic acid as the stabilizer and surface-modification reagent. The 512.4 nm fluorescence emission which was caused by the cavity-electron recombination on surface trap of CdS quantum dots was quenched in the presence of hemin. The quenching mechanism was a dynamic process based on electron transfer between Fe2+of hemin and cavity of CdS quantum dots. Under optimal conditions, a concentration of 5.0×10-6－25.0×10-6g/mL of hemin could be determined on the basis of the decrease ratio of fluorescence intensity of CdS quantum dots,with a detection limit of 3.35×10-8g/mL. The proposed method was utilized to analyze the blood serum sample in which hemin was added with satisfactory results.

CdS quantum dots；hemin；electron transfer；fluorescence quenching

TS264.4

A

1002-6630(2011)03-0051-05

2010-03-15

湖南省教育廳自科基金重點(diǎn)項(xiàng)目(05A009)；湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2005019)；吉首大學(xué)回校博士基金資助項(xiàng)目(JD05001)

張文龍(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榧{米粒子熒光特性及分析應(yīng)用。E-mail：wlaoxi@163.com

*通信作者：陳莉華(1961—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物。E-mail：chenlihua99@163.com