雷生姣，王可興，呂曉燕，潘思軼*

(華中農業(yè)大學 食品科學技術學院，湖北 武漢 430070)

生物工程作為新技術革命的前沿發(fā)展領域，將在人類社會的可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而酶的固定化及酶促反應是最具發(fā)展前景的生物技術工程[1]。固定化酶技術除具有酶催化反應特性外，還能在一定程度上解決酶穩(wěn)定性和重復利用等問題，可適應工業(yè)化批量生產的要求。作為生物催化劑，固定化酶已被廣泛應用于化學、制藥以及食品工業(yè)，因而固定化酶載體的開發(fā)和利用顯得尤為重要[2]。聚乙烯醇(PVA)是一種新型的固定化載體，具有機械強度高、穩(wěn)定性好、價格低廉等優(yōu)點，但由于其具有極強的附聚性，使得其凝膠在制備凝膠珠體時比較困難，不易成型。另一種被廣泛應用的固定化酶載體——海藻酸鈣凝膠含水率高，成形簡單容易，但其網絡的孔隙尺寸太大且凝膠珠機械強度較差，重復使用率不高。如果將兩者進行優(yōu)勢互補，采用復合法制備凝膠，則復合凝膠能滿足優(yōu)質固定化載體的要求[3]。

柚苷酶(EC3.2.1.40)具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性，是一種胞外酶，在pH2.5～6.0具有實用活性，40℃以下活性較高[4]。用于生產柚苷酶的真菌主要為曲霉屬和青霉屬。2000年，Zverlov等[5]將編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因進行克隆并導入埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)中，該基因在埃希氏大腸桿菌中成功的進行了表達。重組技術使得柚苷酶更易獲得且更經濟，在食品工業(yè)和制藥工業(yè)將獲得更大的用途。柚苷酶中的α-L-鼠李糖苷酶能將柑橘汁中的苦味物質——柚皮苷水解為鼠李糖和普魯寧(苦味約為柚皮苷的三分之一)，而普魯寧在β-D-葡萄糖苷酶的作用下能被水解成柚皮素(無苦味)和葡萄糖。國外已有一些報道將柚苷酶固定在不同的載體上后應用于柑橘汁的脫苦[6-8]和增加葡萄酒的風味[9]，并取得了一定的效果。我國對柚苷酶的研究起步較晚，且主要集中在對柚苷酶產生菌的選育與篩選上[10-12]，對其在食品工業(yè)中的應用研究較少，對其固定化的研究處于起步階段。

本實驗以聚乙烯醇和海藻酸鈣為載體，戊二醛為交聯劑，采用延時包埋法[13]，制備性質穩(wěn)定的固定化柚苷酶聚乙烯醇凝珠。針對該載體的結構特點，對固定化酶載體制備條件的優(yōu)化進行考察，同時對固定化酶與游離酶的性質進行比較研究，為固定化柚苷酶的工業(yè)化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柚苷酶(CAS 號：9068-31-9)、柚皮苷(HLPC 98%)美國Sigma-Aldrich公司；聚乙烯醇((1750±50)u)、一縮二乙二醇(DEG)(化學純) 國藥集團化學試劑有限公司；海藻酸鈉(化學純) 上海化學試劑分裝廠。

1.2 儀器與設備

S-3000N型掃描電鏡 日本Hitachi公司；UV-7504型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；410A型pH計 美國Thermo Orion公司；HHS-型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柚苷酶活力的測定

游離酶活力測定[14]：5mL具塞試管中加入0.6mL底物柚皮苷(500μg/mL)和0.3mL醋酸緩沖液(0.2mol/L，pH4.0)，在60℃的恒溫水浴鍋中保溫5min后立即加入0.1mL柚苷酶液(2.0mg/mL)，置入60℃的恒溫振蕩器(150r/min)中準確反應 30min；取出反應液，添加4mL蒸餾水和4.9mL體積分數90%的一縮二乙二醇 (DEG)，40℃恒溫水浴鍋中預熱3～5min，再加入4.0mol/L NaOH 0.1mL，充分搖勻，在水浴鍋中保溫發(fā)色10min；取出注入1cm比色皿內，用紫外分光光度計在420nm波長處測定吸光度，通過柚皮苷標準曲線計算酶活力。以0～250μg/mL 柚皮苷為標準溶液，測定420nm波長時的吸光度，制作標準曲線。同時以0.1mL醋酸緩沖液代替酶液作對照，以緩沖液作空白。

固定化酶活力測定：方法與游離酶活力測定基本相同，只需將酶液用1g固定化酶凝珠代替，將0.3mL緩沖液添加至0.4mL即可，其他均相同。

酶活力定義(U)：在測定條件下(60℃，pH4.0)，每分鐘消耗1μg柚皮苷所需的酶量為一個酶活力單位。

游離酶或固定化酶相對活力是指在同組實驗中以活力最高的為100，與其余的游離酶或固定化酶的活力之比，以百分數表示。

1.3.2 固定化酶凝膠顆粒的制備

按9.0g/100mL的PVA和1.0g/100mL的海藻酸鈉比例配制100g載體溶液，待溶液完全冷卻后，加入體積分數2.0%的戊二醛，充分混勻，置室溫下交聯3h。在延時交聯后的載體中加入10mL(2.0mg/mL)的酶液，充分混勻后于15℃的恒溫振蕩器(150r/min)中吸附10h，再用5mL注射器均勻地注入4.0g/100mL的硼酸和0.5g/100mL的CaCl2溶液中形成3～5mm的凝珠，于4℃冰箱中固化1h后，用蒸餾水潤洗3次；最后置于－40℃的冰柜中凍存30min，4℃冰箱中解凍，如此往復循環(huán)3次后[15]，用濾紙吸干凝珠表面的水分，存放于4℃冰箱中冷藏待用。

1.3.3 游離酶與固定化酶的酶學性質研究

在最佳固定化條件下，制得PVA-海藻酸鈉固定化柚苷酶，按照酶活力測定方法，分別測定游離酶與固定酶的酶活。將底物柚皮苷溶液配制成不同pH值的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH2.8～5.2)，分別向不同pH值的底物溶液中加入游離酶或固定化酶，60℃反應30min后測定酶活力，確定游離酶與固定化酶的最適pH值；將游離酶與固定化酶分別置于不同溫度(30～80℃)的水浴鍋中反應30min后，取樣測定酶活力，確定游離酶與固定化酶的最適反應溫度；將游離酶或固定化酶與不同質量濃度底物柚皮苷溶液作用，測定反應初速度，用Lineweaver-Burk 雙倒數作圖法求出酶的Km值；將游離酶與固定化酶分別在60℃的水浴鍋中保溫不同的時間后，取樣在最適反應溫度下測定酶活力，比較游離酶與固定化酶的溫度耐受性；將固定化酶與底物柚皮苷溶液反應完成后，取出用0.2mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0)洗滌至無反應產物殘留，重新裝入新鮮底物溶液，測定固定酶活力，以此進行多次水解循環(huán)來測定固定化酶的重復使用性。

1.3.4 PVA-海藻酸鈉固定化柚苷酶

配制9.0g/100mL聚乙烯醇和1.0g/100mL海藻酸鈉載體溶液100g，待溶液完全冷卻后，按不同固定化方法制備固定化酶，具體如下：將100g載體溶液平均分成4份，其中兩份不加戊二醛，兩份按2%比例(占總體積)加入戊二醛；再分別將一份未加戊二醛和一份添加了戊二醛的載體溶液置室溫下自交聯3h；另兩份即刻加入2.5mL(2.0mg/mL) 的酶液，再按固定化酶凝膠顆粒的后續(xù)制備方法制備固定化酶；自交聯的載體溶液交聯3h后，即刻加入2.5mL(2.0mg/mL)的酶液，同樣按固定化酶凝膠顆粒的后續(xù)制備方法制備固定化酶。按酶活力測定方法測定固定化酶的相對活力。

2 結果與分析

2.1 固定化酶工藝條件優(yōu)化

2.1.1 PVA-海藻酸鈉固定化柚苷酶方法的確定

圖1 不同固定化方法對酶活力的影響Fig.1 Effect of different immobilization methods on activity of naringinase

由圖1可知，采用添加戊二醛和延時交聯的包埋方法制備的固定化酶活力較高。這主要是因為戊二醛是一種雙功能交聯劑，有二個醛基，可以使PVA-海藻酸鈉分子內和分子間相互形成交聯，同時也可以使酶交聯在載體上。適宜的戊二醛使得PVA-海藻酸鈉分子能形成穩(wěn)定的網絡結構，提高酶的固定化率。所以，在優(yōu)化固定化條件時，確定載體的交聯時間為3h和較適宜的戊二醛體積分數為2.0%。

2.1.2 不同質量濃度PVA-海藻酸鈉配比對固定化作用的影響

按表1中的PVA-海藻酸鈉的配制不同質量濃度的混合載體溶液，再按1.3.2節(jié)方法不改變其他條件制備固定化酶凝珠，按固定化酶活力測定方法測定酶的相對酶活力。

表1 PVA-海藻酸鈉濃度對固定化酶活力的影響Table 1 Effect of PVA-alginate concentration on activity of immobilized naringinase

由表1可知，以9.0g/100mL的PVA溶液固定化柚苷酶時，固定化酶的相對酶活力較高，且凝珠易成型，珠體光潔、圓整，并具有適中的凝膠強度；當PVA質量濃度過低時，凝珠成型時間較長，且不易成型，凝膠強度也較弱；但當PVA質量濃度過高時，由于溶液黏度較高，凝珠不易成球，而且推壓針筒時感到非常費力，有嚴重的拖尾現象。海藻酸鈉的質量濃度同樣也影響著酶的固定率，海藻酸鈉質量濃度過高時，溶液的黏度較高，不利于凝珠的成型，固定化酶的相對酶活力也有所下降，這主要是因為較多的海藻酸鈣導致了固定化顆粒內部孔徑的減少，影響底物柚皮苷與酶的接觸及產物的傳質；當海藻酸鈉質量濃度過低時，形成的凝膠強度較低。因此，按9.0g/100mL的PVA與1.0g/100mL的海藻酸鈉配比制備載體時，固定化酶的相對酶活力最高，此條件下固定化有利于酶活力的發(fā)揮和產物的傳出。

2.1.3 固化液CaCl2質量濃度對固定化酶活力的影響

按1.3.2節(jié)的方法，其他固定化條件不變，分別加入不同質量濃度的固化液CaCl2溶液，制備固定化酶凝珠，按固定化酶活力測定方法測定酶的相對活力，結果如圖2所示。

圖2 CaCl2質量濃度對固定化酶活力的影響Fig.2 Effect of CaCl2 concentration on activity of immobilized naringinase

實驗過程中，固化液中4.0g/100mL硼酸的量是過量的[16]，因此不需要進行優(yōu)化，但CaCl2的質量濃度對固定化酶活力的影響較大。當CaCl2質量濃度過低時，制備的凝膠顆粒較軟，形成的凝膠網狀孔徑比較大，截留的酶較少，在水解柚皮苷過程中易損壞，影響水解的效率；當其質量濃度過高時，由于過多的Ca2+使網狀孔徑過小，且導致了載體部分孔徑的被堵塞，使得固定化酶的相對酶活力降低。1.0g/100mL CaCl2所制作的固定化酶凝珠易成型，形狀均勻、具有彈性，無拖尾現象，且制備的固定酶的相對酶活力最高。因此，固化液中選擇1.0g/100mL為最佳的CaCl2質量濃度。

2.1.4 酶液質量濃度對固定化效果的影響

按1.3.2節(jié)的方法，其他固定化條件不變，分別加入不同質量濃度的柚苷酶溶液，制備固定化酶凝珠，按固定化酶活力測定方法測定酶的相對酶活力，結果如圖3所示。酶液質量濃度在0.5～2.0mg/mL時，隨著酶液質量濃度的增大，固定化酶的相對酶活力快速增加。當酶液質量濃度增至2.0mg/mL時，固定化酶的相對酶活力開始緩慢增加。即對于柚苷酶來說，酶液質量濃度的最佳值為2.0mg/mL。這是因為當酶液質量濃度變大時，單位質量載體上固定的酶也就增加，相對酶活力隨之就增加；但是當酶液質量濃度增大至一定程度時，載體上吸附的酶量逐漸達到平衡，此時酶的相對活力就相對增加緩慢；另外，當載體對酶的吸附量達到飽和時，有些酶分子進入載體深處，底物擴散相對困難，使酶分子發(fā)揮作用的能力減弱。因此，選擇2.0mg/mL的酶液，進行固定化。

圖3 酶液質量濃度對固定化酶活力的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on activity of immobilized naringinase

2.1.5 酶交聯時間對固定化酶活力的影響

按1.3.2節(jié)的方法，其他固定化條件不變，改變固定化酶的吸附時間，制備固定化酶凝珠，按固定化酶活力測定方法測定酶的相對酶活力，結果如圖4所示。

圖4 酶交聯時間對固定化酶活力的影響Fig.4 Effect of crossing time on activity of immobilized naringinase

本實驗固定化酶的方法采用交聯與包埋結合法。由于該載體表面及內部為多孔結構，分子在載體內部的擴散反應需要一定時間。從圖4可知，固定化時間在1～10h內，時間越短，酶的固定化率越低；但超過10h，隨著時間的延長，酶的固定率逐步下降。這是因為如果固定化時間太長，交聯程度高，形成的凝膠網狀結構太緊密，就會影響到酶促反應時的反應速率，檢測到的固定化酶的活力就會下降。因此選擇固定化酶的吸附時間為10h，就能獲得較多活力。

2.2 固定化酶的掃描電鏡(SEM)

在最佳的固定化條件下得到固定化柚苷酶，在掃描電鏡下觀察載體橫截面。濕的PVA-海藻酸鈉微球經SEM觀察前要進行如下幾步處理：1)用0.1mol/L PBS(pH7.2)清洗3次(每次20min)后，在室溫下用體積分數1%四氧化鋨固定2.5h，然后再用0.1mol/L PBS(pH7.2)清洗3次(每次30min)；2)將清洗后的材料分別用體積分數為30%、50%、70%、90%、100%的乙醇逐級脫水3次(每次30min)，再用乙酸異戊酯-乙醇體積比為1:1的混合溶液代換1次，體積分數100%的乙酸異戊酯代換1次(30min)；3)將充分脫水后的樣品放入CO2臨界點干燥儀(HCP-2型)中干燥，干燥后的微球經離子濺射儀(EikoIB-5)鍍金膜后SEM觀察拍照，加速電壓為20kV。

對固定化酶而言，載體結構直接影響著固定化酶的活性。多孔且具有較高比表面積的高分子微球，被認為是固定化酶的理想結構。由圖5可看出，載體孔結構內外相連，表面存在大量孔徑50nm左右的孔結構，具有較大比表面積。因而酶固定在載體上后，酶分子被束縛在有限的空間結構內，使得酶分子無法自由變構，從而保持了酶的活性[17]。

圖5 PVA-海藻酸鈉固定化柚苷酶的SEM圖(×5000)Fig.5 SEM of the surface configuration of immobilized naringinase with PVA-sodium alginate (×5000)

2.3 游離酶與固定化酶的酶學性質

2.3.1 游離酶與固定化酶的最適pH值

在不同pH值的0.2mol/L的醋酸緩沖溶液中，測定游離酶和固定化酶的相對活力。由圖6可知，該固定化酶與游離酶的最適pH值均為4.0，說明PVA-海藻酸鈉固定化柚苷酶后對酶反應的最適pH值沒有影響。當pH值低于4.0時，游離酶的相對酶活力較固定化酶高，但pH值大于4.0后，固定化酶的活力下降緩慢，游離酶的活力下降迅速；同時，固定化酶對pH值的敏感度較游離酶低，適應的范圍比較廣。

圖6 游離酶與固定化酶的最適反應pH值Fig.6 Optimal reaction pH of free and immobilized naringinase

2.3.2 游離酶與固定化酶的最適溫度

圖7 游離酶與固定化酶的最適反應溫度Fig.7 Optimal reaction temperature of free and immobilized naringinase

從圖7可知，固定化酶與游離酶在溫度30～70℃范圍內相對酶活力隨溫度升高而增大，在70℃時，相對酶活力均達到最大。這表明柚苷酶固定化后對其最適溫度沒有影響。但溫度高于70℃后，由于PVA在高溫下能溶解，因此固定化酶的使用溫度不能高于此溫度；游離酶在溫度高于70℃時，相對酶活力迅速下降，因此也不適宜在此溫度范圍內使用。因而，固定化酶與游離酶的最適溫度均為70℃。

2.3.3 游離酶與固定化酶的動力學行為

酶經過固定化后，酶蛋白質的結構會發(fā)生一定程度的變化；同時由于載體的影響，與底物的親和力也會發(fā)生改變。圖8為游離酶與固定酶的Lineweaver-Burk曲線，并求得固定化酶及游離酶的Km分別為4.263mmol/L和 2.747mmol/L。由此可知，固定化酶的Km值高于游離酶。Km大，表示酶與底物的親和力小，反之，表示酶與底物的親和力大。這說明柚苷酶經過PVA-海藻酸鈉載體固定化后，其與底物的結合能力變弱。這可能是因為載體所帶電荷和底物所帶電荷相同時，他們之間產生了排斥作用；又或是因為酶經過固定化后產生了立體障礙或擴散阻力，從而導致Km值升高。

圖8 游離酶與固定化酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.8 Lineweaver-Burk curve of free and immobilized naringinase

2.3.4 游離酶與固定化酶的熱穩(wěn)定性

圖9 游離酶與固定化酶的熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stability of free and immobilized naringinase

由圖9可知，固定化酶與游離酶在60℃時保溫90min以內相對酶活力均沒有明顯的降低，保溫時間超過90min后游離酶活力迅速下降，而固定化酶活力下降緩慢。當保溫時間達到150min時，游離酶相對活力僅為30.87%，而固定化酶相對活力高達72.84%，這表明固定化酶在60℃時的熱穩(wěn)定性明顯高于游離酶。因此，酶和高分子載體結合后，結構變得牢固，酶的構相被固定，即使受熱，酶蛋白鏈也難以伸展，酶蛋白的高級結構得以維持，所以固定化酶的穩(wěn)定性顯著提高。

2.3.5 固定化酶的重復使用性

圖10 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.10 Stability of immobilized naringinase

以第一次測得的酶活力為100，計算各自相對酶活力，結果如圖10所示，經過重復使用6次后，固定化酶的相對酶活力仍保持為60%左右。這表明柚苷酶經過固定化后具有良好的重復使用性，這為固定化柚苷酶應用于果汁脫苦提供參考。

3 討 論

聚乙烯醇和海藻酸鈉來源豐富、無毒、化學性質比較穩(wěn)定，是性能良好的固定化酶載體，具備規(guī)模生產的條件。海藻酸鈉溶液可以與Ca2+離子反應形成凝膠，凝膠可以在室溫或任何高于100℃的溫度條件下形成，加熱也不融化；而聚乙烯醇在硼酸溶液中形成的凝膠孔隙較大。結合它們的優(yōu)點制備的固定化酶載體，易于底物與酶的接觸和產物的自由流出，同時利用交聯劑——戊二醛提供的醛基，使PVA-海藻酸鈉分子內和分子間形成交聯，提高了酶的催化效率。固定化酶凝珠內部具有規(guī)則的通孔結構，具有很大的內表面積，能有效地包埋、截留柚苷酶，并且有利于底物和產物的擴散。結果表明：9.0g/100mL的聚乙烯醇與1.0g/100mL的海藻酸鈉配比時，固定化酶的相對酶活力較高，催化效果較好。柚苷酶經過固定化后，熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性提高了；重復使用6次，相對酶活力仍可保持60%。

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