唐 濤 謝 彤 齊宏旭 胡 平

引導(dǎo)組織再生(GTR)用于牙周組織缺損修復(fù)。此方法將一種屏障材料置于牙根和牙齦瓣之間，阻擋牙齦結(jié)締組織細(xì)胞和上皮細(xì)胞與牙根先接觸，保證牙周膜組織來源細(xì)胞和牙槽骨細(xì)胞優(yōu)先占據(jù)牙根面而生長，使組織修復(fù)再生能力得到最大限度發(fā)揮。靜電紡絲是制備超細(xì)纖維的一種重要方法，得到的電紡纖維具有直徑小(幾納米至幾微米)、比表面積高等特點(diǎn)。靜電紡絲過程是將具有一定粘度的高分子溶液或熔體置于帶有金屬毛細(xì)管噴頭的裝置中，在高壓電場的作用下，處于噴口的液滴克服表面張力形成噴絲細(xì)流，在到達(dá)接收裝置之前，細(xì)流不斷分裂細(xì)化及溶劑揮發(fā),最后形成電紡纖維。若液體在連續(xù)的推動(dòng)供給下，可得到一定厚度的超細(xì)纖維膜。本文利用靜電紡絲技術(shù)用羧甲基殼聚糖復(fù)合生長因子(rhBMP2)緩釋微球制備牙周組織再生引導(dǎo)膜具有臨床指導(dǎo)意義，并研究其釋藥特點(diǎn)。

1.實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

1.1 主要試劑 羧甲基殼聚糖(山東醫(yī)療器械研究所Mw=50萬)；二氯甲烷(韋斯實(shí)驗(yàn)用品有限公司A.R.)；納米羥基磷灰石(清華大學(xué)核研院)；聚乙烯醇(百靈威科技有限公司A.R)；氣溶膠(AOT)(北京化學(xué)試劑公司A.R.)；氯化鈣(韋斯實(shí)驗(yàn)用品有限公司)； 海藻酸鈉(Alg)(北京化學(xué)試劑公司)；生長因子(rhBMP2)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備 光電天平(DT-100)(北京光學(xué)儀器廠)；電磁攪拌加熱套(DHS)(山東華魯電熱設(shè)備有限公司)；真空干燥箱(ZK-82B)(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)；掃描電鏡(s-5500)(日本Hitachi公司)；顯微數(shù)碼照相系統(tǒng)(DP50)(日本Olympus公司）。

1.3 方法

1.3.1 載藥微球的制備及電鏡表征

乳化劑：氣溶膠即雙-[2-乙基己基]-琥珀酸磺酸鈉(AOT)；

藥物載體：海藻酸鈉（溶有生長因子即骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhBMP)，其含量不超過0.5%)；

交聯(lián)劑：氯化鈣；

實(shí)驗(yàn)步驟：把0.5g AOT溶于25ml的二氯甲烷中，再逐滴加入3ml 1.0 wt%的海藻酸鈉溶液。在1200轉(zhuǎn)/s的轉(zhuǎn)速下攪拌10min后，再逐滴加入1ml 5wt%的氯化鈣溶液。繼續(xù)攪拌10min；最后得到的油包水的溶液。即完成鈣藻酸鹽微球?qū)ιL因子進(jìn)行載藥的制備。其中的小球平均直徑為(7±2)um。為了在海藻酸鈣微球中負(fù)載生長因子，一定質(zhì)量的生長因子提前溶解到海藻酸鈉水溶液中。掃描電鏡下電壓為20kv×2000倍和4000倍照片表征見圖1。

1.3.2 羧甲基殼聚糖引導(dǎo)牙周組織再生纖維膜的制備及電鏡表征 首先采用精制的聚乙烯醇為單體與羧甲基殼聚糖等比混合成紡絲溶液。再將液相共沉淀法制備的納米級羥基磷灰石溶解后，加入上述配成的混合紡絲溶液中，機(jī)械攪拌后，通過超聲分散，即得纖維主體可降解的羧甲基殼聚糖羥基磷灰石混合溶液。然后將載藥后鈣藻酸鹽微球混入此溶液中，得到具有一定粘度的高分子溶液。

本實(shí)驗(yàn)將上述濃度為3-12wt%的高分子溶液置于帶有金屬毛細(xì)管噴頭的裝置中，在高壓電場的作用下，處于噴頭的液滴克服表面張力形成一股帶有電荷的噴射流。在到達(dá)接收裝置前，噴射流逐漸被拉長變細(xì)及溶劑揮發(fā)，最后形成“串珠”絲狀結(jié)構(gòu)的電紡納米纖維。靜電紡絲過程于室溫下，用0.9mm平頭針，10-20kv的電壓，8-15cm的距離進(jìn)行，纖維在接地的鋁泊上收集，直到纖維膜的厚度達(dá)到所需要求，即得羧甲基殼聚糖引導(dǎo)牙周組織再生纖維膜。樣品進(jìn)一步處理后在掃描電鏡下電壓為20kv×500倍和2000倍觀察見圖2，膜的實(shí)物照片見圖3。

1.3.3 體外釋藥實(shí)驗(yàn) 體外釋放是在0.9%的氯化鈉水溶液中進(jìn)行，精確稱一定量的電紡絲纖維膜放到離心管里，再加入10ml釋放介質(zhì)。每個(gè)樣品重復(fù)測量3次取其平均值，每條釋放曲線的樣品來自于同一個(gè)纖維膜的不同部分。離心管被放到37℃的水浴搖床中，選擇每隔20hr的時(shí)間間隔取出試樣。生長因子的濃度用紫外分光光度計(jì)測定。

圖4所示的體外釋放結(jié)果顯示，

2.結(jié)果

用靜電紡絲技術(shù)將載藥后鈣藻酸鹽微球與主體羥基磷灰石羧甲基殼聚糖混合制得了具有“串珠”絲狀結(jié)構(gòu)的復(fù)合纖維膜圖3。

體外釋放試驗(yàn)曲線看出約在50hr時(shí)微球的釋放速率約為96%，復(fù)合纖維膜的釋放速率約為78%，50hr之后兩者釋放接近平緩。

3.討論

牙周引導(dǎo)組織再生的核心是通過在牙根面與齦瓣之間放置生物屏障膜以引導(dǎo)牙周組織再生，而GTR在恢復(fù)牙周組織的生理結(jié)構(gòu)功能、材料性能和對一些牙周較大缺損的修復(fù)再生上還遠(yuǎn)未達(dá)到所期望的目標(biāo)[1,2]。本實(shí)驗(yàn)采用的纖維膜材料則具有良好的生物相容性和降解性，其一方面能誘導(dǎo)牙周組織生長，另一方面能阻擋結(jié)締組織和上皮細(xì)胞進(jìn)入牙周組織缺損區(qū)域。

羧甲基殼聚糖是殼聚糖的衍生物，水溶性，具有殺菌消炎作用，良好的生物相容性和生物降解性，可引導(dǎo)組織再生重建，降解吸收，不必二次手術(shù)取出[3]。盧鳳琦[4]進(jìn)行生物學(xué)評價(jià)其無細(xì)胞毒性、不溶血、不致熱、不致敏，具有很好的表面相容性和機(jī)械性能。吳勇[5]報(bào)道殼聚糖膜的降解性能基本符合牙周組織再生要求。羥基磷灰石是人體自然骨的主要成分，具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性[11]，提高了膜的力學(xué)性能和拉伸強(qiáng)度。由于單純的羧甲基殼聚糖溶液靜電紡絲效果不佳，經(jīng)過加工羧甲基殼聚糖共混的乙烯醇和羥基磷灰石，通過分子間的氫鍵及其良好的相容性來改善羧甲基殼聚糖的可電紡性[6]。

在制備中通過改變電紡參數(shù)如電壓、噴絲口與接收屏之間的距離、紡絲液的流量以及溶液濃度、表面張力和電導(dǎo)率等，可控制纖維直徑的粗細(xì)，膜的厚度，孔隙率等，根據(jù)牙周引導(dǎo)組織再生特性可以設(shè)計(jì)出多種功能的梯度結(jié)構(gòu)膜材料。

本試驗(yàn)制備的膜將參照莊昭霞、吳勇[4,5]等文獻(xiàn)介紹的方法對其進(jìn)行生物學(xué)評價(jià)、膜降解時(shí)間和機(jī)械性能等測試，能否達(dá)到牙周組織引導(dǎo)再生的要求將另文報(bào)道。

圖1中看到大小不一的微球，可能是因溶液濃度的不均一，且沒有充分?jǐn)嚢杈鶆虻扔绊懸蛩囟?，但通過篩分可濾出大小一致的微球。因沒有更高倍的掃描電鏡圖所示，尚需進(jìn)一步研究影響因素予以補(bǔ)充說明。

圖4中表明的釋放初期2個(gè)樣本中都觀察到突釋現(xiàn)象。這可能是由于蛋白被吸附到表面或者在表面上松散的聚集。rhBMP2從纖維中的釋放始終比微球中的釋放緩慢，突釋降低，顯示出延長的釋放效果，約在50h以后藥物釋放速率緩慢，纖維與微球降解速率接近平穩(wěn)，釋放行為遵守藥物控釋機(jī)制，起到緩釋作用。這是因?yàn)槔w維外層對內(nèi)部藥物滲透的阻礙作用。另外，也證明載藥微球被包復(fù)到纖維當(dāng)中，和其他成熟的制備微膠囊的技術(shù)(例如溶劑揮發(fā)和噴霧干燥技術(shù))相比，電紡絲的方法具有競爭和互補(bǔ)的優(yōu)勢。

生長因子(即重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白rhBMP2)是一類小分子蛋白，在血液和組織中含量微小，具有多種調(diào)節(jié)功能,在組織修復(fù)過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、趨化、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的生物合成等，能明顯促進(jìn)牙周組織的再生和修復(fù)[7]。緩釋微球系統(tǒng)可以避免蛋白類藥物體內(nèi)降解失活和藥物的突釋作用，減少用藥量和藥物的副作用[8]。本實(shí)驗(yàn)采用鈣藻酸鹽微球包裹生長因子以“串珠”絲狀特殊結(jié)構(gòu)復(fù)合到電紡纖維中，能增大藥劑的表面積，其隨纖維降解而緩慢持續(xù)地釋放出來，有效地保證其在缺損局部的治療濃度和作用時(shí)間，最大限度地發(fā)揮藥物的功效[9]。

將藥物控釋技術(shù)引入牙周組織再生術(shù)還能讓膜材料負(fù)載抗生素及各種生長因子，既有效控制牙周炎癥，改變傳統(tǒng)的牙周給藥方式，減少藥物副作用，又可向種子細(xì)胞定量、持續(xù)釋放，為口腔組織工程提供種子細(xì)胞[10]。電紡纖維不僅單獨(dú)用于控制釋藥，還用作組織工程中的生物模板，釋放生長因子以輔助牙周組織細(xì)胞的生長和分化。因此纖維膜攜帶生長因子等成分并用作組織工程支架，進(jìn)一步豐富電紡絲的研究范圍和其在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

目前這種含有生長因子緩釋系統(tǒng)的再生膜還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段,許多問題亟待解決。該膜是否可以應(yīng)用于臨床尚需要生物學(xué)性能測試和評價(jià)。

3.結(jié)論

用靜電紡絲技術(shù)平臺制備緩釋再生引導(dǎo)膜是可行的，這一技術(shù)為牙周組織再生術(shù)的完善和發(fā)展提供新的研究空間。

[1]陳發(fā)明,吳織芬,金巖.引導(dǎo)牙周組織再生在伴牙槽骨缺損牙再植術(shù)中應(yīng)用的回顧性研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2004,20(5):500-503

[2]魯 紅,吳織芬,田 宇等.細(xì)胞-支架構(gòu)建方式的牙周組織工程實(shí)驗(yàn)研究[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,2004,39(3):189-192

[3]張 毅,莊昭霞,盧鳳琦等.牙周引導(dǎo)組織再生殼聚糖膜的生物相容性研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2002,40(2):115

[4]盧鳳琦,莊昭霞,曹 晶等.可降解殼聚糖復(fù)合膜的研制和生物學(xué)評價(jià)[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2003,20(2):280-283

[5]吳 勇,王勤濤,吳織芬等.殼聚糖屏障膜機(jī)械性能與降解性能的研究[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2004,20(5):279-281

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[8]陳發(fā)明.生長因子復(fù)合生物膜引導(dǎo)牙周組織再生[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2004,14(10):589-592

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[10]鄂玲玲,劉洪臣,蘇 方，等.犬脂肪基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及分化研究[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2008,6(4):196-200

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