趙春林 ，吳 潤(rùn) ，李發(fā)弟 ，柳紀(jì)省 ，王 川 ，王 芳

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

小尾寒羊PRNP等位基因密碼子136、154和171的多態(tài)性研究

趙春林1，2，吳 潤(rùn)1，2，李發(fā)弟3，柳紀(jì)省1，王 川2，王 芳2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

為研究小尾寒羊PRNP等位基因密碼子多態(tài)性，本研究以綿羊全血基因組DNA為模版，通過PCR，擴(kuò)增綿羊PRNP等位基因目的片段，并將其克隆于pMD-18T載體。經(jīng)SSCP法篩選出陽(yáng)性克隆后測(cè)序，確定各綿羊PRNP 136位、154位和171位密碼子等位基因型及頻率分布。在104只綿羊中共檢出15個(gè)PRNP 136位、154位和171位密碼子等位基因型，癢病易感基因型占優(yōu)勢(shì)(53.85%，56/104）。本研究證明，該綿羊群屬于癢病易感/易發(fā)群體，一旦癢病傳入具有罹患癢病的極大可能性。

綿羊；PRNP等位基因；136，154和171位密碼子；多態(tài)性；PCR-SSCP

綿羊PRNP基因型多態(tài)性研究已經(jīng)證實(shí)136，154和171密碼子與綿羊癢病的易感性/抗性存在極相關(guān)性。中國(guó)綿羊群體雖以癢病易感性基因型為主[1-3]，但尚未實(shí)施綿羊抗癢病育種計(jì)劃，具有癢病傳入感染和發(fā)生的極大隱患。目前，國(guó)內(nèi)進(jìn)行綿羊PRNP密碼子136、154和171多態(tài)性研究多局限于單倍型分析，等位基因多態(tài)性及其基因型頻率分布調(diào)查卻很少[1]。因此，用簡(jiǎn)便可行且成本低廉的方法來分析綿羊PRNP等位基因多態(tài)性和基因型頻率分布，對(duì)抗癢病育種計(jì)劃實(shí)施具有重要意義。本研究以在甘肅省永昌羊場(chǎng)隨機(jī)采集的104只小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，用PCR-SSCP技術(shù)進(jìn)行該綿羊群體PRNP等位基因密碼子136、154和171多態(tài)性研究，探明其等位基因型種類及其頻率分布，對(duì)該綿羊群體的癢病易感性做出評(píng)估，為建立綿羊PRNP等位基因型快速檢測(cè)和分型方法提供實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并為抗癢病育種工作提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 血樣及試劑 從甘肅省永昌羊場(chǎng)隨機(jī)抽取104只健康小尾寒羊，分別采取頸靜脈血液樣品，按1∶5加入ACD抗凝，分裝并保存于-70℃。全血基因組DNA提取試劑盒、PremixTaq酶、限制性內(nèi)切酶、pMD18-T載體等購(gòu)自寶生物工程(大連）有限公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照綿羊朊蛋白基因序列，用Primer Premier 5.0在綿羊PRNP完整開放閱讀框(ORF）內(nèi)針對(duì)包含136、154和171密碼子的片段設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[4]，預(yù)計(jì)可擴(kuò)增PRNP開放閱讀框+360～+627位約為268 bp的目的DNA片段。

1.3 PRNP等位基因DNA片段的PCR擴(kuò)增和電泳以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL，其中 PremixTaq25.0 μL、綿羊基因組 DNA 1.0 μL(50 pmol/L）、上下游引物各 1.0 μL(10 pmol/L）、ddH2O 22.0 μL。離心混勻后置PCR擴(kuò)增儀中，94℃預(yù)變性 5 min；94℃ 45 s、60℃ 45 s、72℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

1.4 綿羊PRNP等位基因純合子、雜合子的SSCP分析 2.0 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與8.0 μL變性上樣緩沖液離心混勻后，于98℃變性10 min，立即置于冰浴中10 min后上樣，在文獻(xiàn)[4]的條件下進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析。電泳后進(jìn)行銀染，觀察帶型并判定PRNP等位基因純合子或雜合子綿羊個(gè)體。

1.5 綿羊PRNP等位基因的克隆及其篩選與鑒定將目的DNA片段克隆于pMD-18T載體后進(jìn)行等位基因克隆的篩選及鑒定。對(duì)于純合子綿羊個(gè)體，在一個(gè)平板上挑選3個(gè)形態(tài)一致的無色透明菌落，雜合子挑選10個(gè)菌落。提取重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定后在相同條件下進(jìn)行基因組擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析鑒定，挑選1個(gè)(純合子）或1對(duì)(雜合子）等位基因陽(yáng)性克隆。PRNP密碼子136、154和171等位基因型經(jīng)測(cè)序判定后分析其基因型頻率，評(píng)估該綿羊群體癢病易感性。檢測(cè)除綿羊PRNP 136、154和171外其它已知或未知密碼子突變，并分析其規(guī)律。

2 結(jié)果與討論

2.1 綿羊PRNP等位基因SSCP分析及其隆鑒定在104只綿羊的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP分析中，依條帶數(shù)共出現(xiàn)4條、3條和2條條帶的3類帶型；呈現(xiàn)4或3條帶的綿羊?yàn)殡s合子個(gè)體，出現(xiàn)2條帶者為純合子個(gè)體。預(yù)選陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中均出現(xiàn)一條大于250 bp的條帶，與預(yù)期目的片段大小基本符合；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)陽(yáng)性重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物，均在250 bp～500 bp之間和大于2 000 bp位置各有一條條帶，與預(yù)期目的片段、載體片段大小基本相符；應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)成功地鑒定并挑選出104只綿羊PRNP等位基因的陽(yáng)性克隆。

2.2 陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果比對(duì)及其基因型判定、變異位點(diǎn)分析 104只綿羊的PRNP等位基因密碼子136、154和171純合子基因型占 62.5%(65/104）、雜合子基因型占37.5%(39/104）。其中癢病易感基因型ARQ/ARQ 36.54%(38/104）、ARQ/ARH 10.58%(11/104）、VRQ/ARQ 4.81%(5/104）、ARH/ARH 1.92%(2/104），共計(jì)53.85%(56/104）；癢病半抗性基因型ARR/ARQ 11.54%(12/104）、ARR/ARH 0.96%(1/104），共計(jì) 12.50%(13/104）；癢病抗性基因型ARR/ARR 22.12%(23/104）；未知與癢病關(guān)系的基因型 AHR/ARQ 0.96%(1/104）、ARK/ARQ 3.85%(4/104）、 ARK/ARH 1.92% (2/104）， TRQ/TRQ、TRQ/ARR、TRQ/ARQ、ARQ/ARP和 ARK/ARK各0.96%(1/104），共計(jì)11.54%(12/104）。該群體綿羊癢病易感基因型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，具有癢病感染或發(fā)生的高度易感性，具有罹患輸入性癢病的極大可能性，再次證明我國(guó)綿羊存在癢病高危群體[1-2，5-6]。研究還發(fā)現(xiàn)了國(guó)內(nèi)相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)的極低頻率的ARK/ARK和ARK/ARH基因型[5-6]，其與癢病的關(guān)系至今尚不明了。目前國(guó)內(nèi)綿羊PRNP等位基因研究中已發(fā)現(xiàn)密碼子136均為A/A型[5-6]，而本次研究在5只綿羊中發(fā)現(xiàn)了A136V、3只綿羊中發(fā)現(xiàn)了A136T突變；國(guó)內(nèi)綿羊中已發(fā)現(xiàn)R154H和Q171R/K/H突變及單倍型ARH[1-2，5-6]，而本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)1只綿羊有R154H突變、36只綿羊有Q171R突變、7只綿羊有Q171K突變、16只綿羊有Q171H突變。AHR、AHQ、VRQ和TRQ單倍型在國(guó)內(nèi)尚為首次發(fā)現(xiàn)，其頻率很低(＜0.96%）(圖1）。

注綿羊群體PRNP的121位～209位的片段中，除密碼子136、154和171外另發(fā)現(xiàn)18個(gè)其他突變位點(diǎn)，其中L141F、R167G、N176Y和Q189L為已發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，Y131N、L133P、G134R、E149V、M157T、 Y158H、 N162P、 Y166D、 F178S/L、C182S、E199V/L、N200I、F201S、M209T 為新發(fā)現(xiàn)的14個(gè)突變位點(diǎn)。L141F和Q189L在國(guó)內(nèi)外已有發(fā)現(xiàn)，而R167G和N176Y突變?cè)趪?guó)內(nèi)未見報(bào)道[1-2，5-6]。以上這些突變的意義不詳，還需今后進(jìn)一步探究。本研究發(fā)現(xiàn)4例ARQ(141F）、2例ARK(141F）和2例ARH(141F），這與141F突變經(jīng)常發(fā)生在ARQ單倍型并很可能與該單倍型相關(guān)聯(lián)的結(jié)論[7-9]相類似。另外，在33例中檢出Q189L突變，其中21例為ARQ(189L）等位基因型；發(fā)現(xiàn)8例L141F突變，6例見于ARQ/ARQ基因型，2例存在于ARK/ARQ基因型；發(fā)現(xiàn)9例R167G突變，7例出現(xiàn)于ARQ/ARQ基因型。可見，在該綿羊群體中141F、167G和189L突變多發(fā)生于ARQ等位基因型中，可能與ARQ相關(guān)聯(lián)，對(duì)此還需進(jìn)一步證實(shí)。

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Polymorphisms of PRNP Alleles in small tail Han sheep

ZHAO Chun-lin1,2,WU Run1,2,LI Fa-di3,LIU Ji-xing1,WANG Chuan2,WANG Fang2

(1.State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology,Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046,China;2.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;3.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China）

The PRNP allelic fragments in Small Tail Han Sheep were amplified by PCR with specific primers and cloned into pMD-18T vector.Positive clones were confirmed by enzymatic digestion,SSCP and sequenced.Fifteen genotypes of PRNP allele at codon 136,154 and 171 were detected.The high scrapie susceptibility genotypes observed in this breed was 53.85%.The results showed this flock was a high risk population of the scrapie susceptibility/outbreaks.

sheep;PRNP allele;codons 136,154 and 171;polymorphism;PCR-SSCP

S852.2

A

1008-0589(2010）01-0074-03

2008-12-08

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20060733006）；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目(GNSW-2005-11及GNSW-2007-04）；家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(2008-2009）

趙春林(1982-），男，甘肅天水人，博士研究生，從事動(dòng)物病原微生物分子生物學(xué)及其致病機(jī)理研究.

*通信作者：E-mail：wurun@gsau.edu.cn

趙曉巖）