趙全民,于 錄,鄧旭明,王春雨,曾凡麗,王全凱*
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林長春130118;2.人獸共患病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室吉林大學(xué)人獸共患病研究所,吉林長春130062)
結(jié)核病是影響人類的最重要的傳染性疾病,世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)2005年全球有8.8百萬人新增結(jié)核病例,其中7.4百萬人在亞洲和撒哈拉以南非洲,導(dǎo)致1.6百萬人死亡;在1980年到2005年間全球約有9千萬結(jié)核患者[1]。結(jié)核病的再次暴發(fā)與人類免疫缺陷病毒(HIV)的出現(xiàn)及耐藥結(jié)核菌的迅速傳播密切相關(guān)[2],因此,急需開發(fā)有抗結(jié)核潛力的新型藥物。但是由于化學(xué)藥物的開發(fā)周期長難度大,而來源于天然植物的中藥在治療結(jié)核病時(shí)具有毒性低,副作用小的特點(diǎn),所以中藥在治療耐藥結(jié)核病方面將大有潛力,已受到越來越多的重視[3-5]。
α-倒捻子素(α-mangostin)是從藤黃科藤黃屬植物山竹子(Garcinia mangostana L.)果殼中分離出的主要生物活性化合物,具有消炎、殺菌、抗阿米巴痢疾和抗?jié)兊幕钚訹6-8]。8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-methoxypsoralen,8-MOP)為中藥補(bǔ)骨脂(Psoralea corylifolia L.)的有效成分之一[7],8-MOP在臨床上已用于治療白癜風(fēng)及銀屑病等皮膚疾患[9],并有報(bào)道表明8-MOP有抗微生物活性[10]。本研究通過2種藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方法MABA分析與試管法同時(shí)測定分析α-倒捻子素和8-MOP對結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌能力,為這2種中藥提取化合物的進(jìn)一步開發(fā)利用和抗分枝桿菌機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。
1.1 菌 株 結(jié)核分枝桿菌H37Rv(ATCC 27294)、H37R(ATCC 25177)購自中國藥品生物制品檢定所。
1.2 培養(yǎng)基 Middlebrook 7H9肉湯為美國BD Difco公司產(chǎn)品。
1.3 試劑和藥物 α-倒捻子素購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;8-MOP、異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(SM)購自美國Sigma公司;利福噴汀(RPT)、卷曲霉素(CAP)、氧氟沙星(OFX)、左氟沙星(LVX)購自中國藥品生物制品檢定所;利福布汀(RBT)購自凱森醫(yī)藥發(fā)展有限責(zé)任公司。INH、EMB和SM的貯存液在去離子水中準(zhǔn)備;環(huán)丙沙星和四環(huán)素在0.01 mol/L鹽酸溶液中準(zhǔn)備;其余藥物的貯存液在二甲亞砜(DMSO)中準(zhǔn)備,充分溶解后以0.22 μm濾膜過濾,-80℃保存。OADC(Oleic acid albumin dextrose catalase)購自美國BD Difco公司;Alamar blue solution購自美國Trek Diagnostics公司。
1.4 Alamar Blue法 在分析之前,在無菌Middle brook 7H9肉湯中稀釋α-倒捻子素、8-MOP和其他9 種 藥 物 (INH、RFP、EMB、SM、RBT、CAP、OFX、LVX、RBT)至4倍最大期望最終檢測濃度。所有菌在37℃ Middle brook 7H9肉湯(含0.2%甘油和10%OADC)中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,將此菌液稀釋至1.0麥?zhǔn)瞎軡岫龋缓笤贛iddlebrook 7H9肉湯中進(jìn)一步1∶20稀釋。
按照文獻(xiàn)介紹的Microplate Alamar Blue Assay(MABA)方法進(jìn)行藥物體外抗分枝桿菌活性測定[11]。簡述如下:試驗(yàn)在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行,200 μL無菌水加入微板的外圍孔中。其他孔加入100 μL上述含甘油和OADC的Middlebrook 7H9肉湯,將100 μL工作濃度藥物注入每行的第一孔中,然后對藥物進(jìn)行二倍系列稀釋。將100 μL接種菌液加入所有檢測孔中以及無藥物對照孔中。每孔中DMSO的終濃度為1%(v/v)。同時(shí),將菌懸液進(jìn)行10∶100和1∶100稀釋,用作10%和1%的細(xì)菌污染檢測。最后各藥物的檢測濃度范圍分別為:α-mangostin:6.25 μg/mL~200 μg/mL; 8-MOP: 4 μg/mL ~256 μg/mL; INH:0.0125 μg/mL~0.8 μg/mL;RFP:0.0125 μg/mL~0.4 μg/mL;SM:0.02 μg/mL~0.64 μg/mL;EMB:0.23 μg/mL~3.76 μg/mL;RFF:0.00625 μg/mL~0.2 μg/mL;RBT:0.00625μg/mL~0.2 μg/mL;OFX:0.125 μg/mL~2.0 μg/mL;LVX:0.125 μg/mL ~2.0 μg/mL;GTX:0.03 μg/mL~1.0 μg/mL;MFX:0.03 μg/mL ~1.0 μg/mL; CAP: 0.08 μg/mL ~1.28 μg/mL;CLF:0.03 μg/mL~0.48 μg/mL。37 ℃孵育5 d后,對照組加入20 μL of Alamar Blue溶液和 12 μL無菌 10%Tween 80,37℃再孵育 24 h。如果板孔變?yōu)榉奂t色,所有孔都以同樣方法加入Alamar Blue Tween溶液,并進(jìn)一步孵育24 h。有確切粉紅色的板孔定義為陽性生長。最低抑菌濃度(MIC)定義為阻止顏色變?yōu)榉奂t色的最低藥物濃度。試驗(yàn)重復(fù)3次。
1.5 試管二倍稀釋法 培養(yǎng)基為含0.025%瓊脂的7H9培養(yǎng)基。接種菌的制備、菌液濃度以及各藥物濃度均同上。置37℃培養(yǎng),4周判定MIC結(jié)果。以無藥物對照生長良好,而未見細(xì)菌生長管的藥物濃度為MIC值。
上述2種方法平行實(shí)驗(yàn),應(yīng)用相同的菌液和濃度以及藥物在同日內(nèi)操作,進(jìn)行3次。MIC結(jié)果為2次及2次以上相同的MIC值。
藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,α-倒捻子素和8-MOP對結(jié)核分枝桿菌H37Rv和H37Ra都有很好的抗菌活性,α-倒捻子素對結(jié)核分枝桿菌H37Rv和H37Ra的MIC均為6.25 μg/mL。而8-MOP對結(jié)核分枝桿菌 H37Rv和 H37Ra的 MIC均為 128 μg/mL,H37Rv和H37Ra對2種藥物不具有耐藥性,而H37Rv相對于H37Ra對EMP和LVX 2種藥物存在耐藥性。2種藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方法MABA分析與試管法測定11種藥物對結(jié)核分枝桿菌H37Rv和H37Ra的MIC具體數(shù)值見表1。Alamar Blue法與試管法對結(jié)核分枝桿菌H37Rv的結(jié)果符合率為90.9%(10/11),2種方法對H37Ra的結(jié)果符合率也為90.9%(10/11),均存在1種藥物的MIC結(jié)果在1個(gè)2倍稀釋度范圍內(nèi)的不一致。
表1 α-倒捻子素和8-MOP及陽性對照藥物抗結(jié)核分枝桿菌活性(μg/mL)Table 1 Antimycobacterial activity of α-mangostin and 8-methoxypsoralen compare to masculine medicine(μg/mL)
目前,植物提取化合物是開發(fā)抗微生物藥物尤其是抗結(jié)核分枝桿菌新型藥物的重要來源。已經(jīng)有多種方法用于植物提取化合物的敏感性檢測,如紙片法,比例法,及BACTEC 460系統(tǒng)等[12],但是這些方法有各自的局限性,如費(fèi)用高、樣品需要量大或因耗時(shí)而至藥物變質(zhì)等。本研究使用的基于Alamar Blue微板分析方法是對純凈化合物和植物粗提物的最好藥敏檢測方法[13],微板分析方法僅需要7 d就可以得到結(jié)果;另外,該方法每孔僅需要200 μL即可操作整個(gè)分析,而其他方法要使用9 mL~10 mL固體介質(zhì)。本研究的結(jié)果說明,Alamar B1ue方法測定藥物對結(jié)核分枝桿菌的抗菌活性具有快速、簡便等特點(diǎn),適用于新型抗結(jié)核化合物的大量篩選。
在本研究中,2種藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方法MABA分析與試管法均表明,植物提取單體化合物α-倒捻子素和8-甲氧基補(bǔ)骨脂素對結(jié)核分枝桿菌H37Rv和H37Ra均有很好的體外抗結(jié)核活性,有藥物開發(fā)潛力。我們正在通過分子生物學(xué)手段對它們的抗菌作用機(jī)制進(jìn)行研究。
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