李俊娟， 李 軍

(1.伊川中醫(yī)院，河南洛陽(yáng) 471300;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100029)

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)。具有溫腎助陽(yáng)，溫脾止瀉的功效。現(xiàn)代藥理研究表明補(bǔ)骨脂具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫等多種藥理活性［1］。補(bǔ)骨脂中的主要化學(xué)成分為香豆素和黃酮類化合物［2-5］，其中所含的呋喃香豆素類成分補(bǔ)骨脂素(psoralen)及異補(bǔ)骨脂素 (isopsoralen)為補(bǔ)骨脂的主要有效成分，研究表明其對(duì)小鼠肉瘤、艾氏腹水瘤等多種瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用［6-7］。雖然對(duì)含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素中成藥中兩種成分定量測(cè)定的方法研究較多，但利用HPLC法對(duì)補(bǔ)骨脂原藥材中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的定量測(cè)定方法研究的比較少［8-12］。本實(shí)驗(yàn)利用HPLC法對(duì)補(bǔ)骨脂藥材中的補(bǔ)骨脂素及異補(bǔ)骨脂素的定量測(cè)定方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

1 儀器及試劑

1.1 儀器及試劑 Waters 600 HPLC色譜系統(tǒng):waters 717自動(dòng)進(jìn)樣器、真空脫氣、四元梯度泵、柱溫箱;2996 DAD檢測(cè)器;Alltima C18高效液相色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)。BP110S電子分析天平;超聲波清洗器;補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)生物制品藥品檢定所 (批號(hào)分別為:07399907;07389907)，純度利用HPLC面積歸一化法測(cè)定大于98.0%，甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑為分析純。

1.2 藥材 10批藥材分別采自河南、陜西、重慶、四川等地和購(gòu)于香港藥材市場(chǎng)，經(jīng)伊川中醫(yī)院李俊娟主管藥師鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Alltima C18高效液相色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水 (50∶50);體積流量1.0 mL/min;柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm;進(jìn)樣量20 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品2.5 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇溶解，用甲醇稀釋至刻度，制備成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，避光放置備用。

2.3 檢出限的測(cè)定 精密吸取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品貯備液適量，進(jìn)行梯度稀釋后，精密吸取各稀釋液20 μL進(jìn)行分析，以信噪比不小于3∶1為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定補(bǔ)骨脂素的檢出限為0.065 ng/mL，異補(bǔ)骨脂素的檢出限為0.053 ng/mL。

2.4 定量限的測(cè)定 精密吸取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品貯備液適量，進(jìn)行梯度稀釋后，精密吸取各稀釋液10 μL進(jìn)行分析，以信噪比不小于10∶1為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定補(bǔ)骨脂素的定量限為0.145 ng/mL，異補(bǔ)骨脂素的定量限為0.127 ng/mL。

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取4.0 mL補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品貯備液于10 mL量瓶中，加入甲醇定容，混勻，制備成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液，精密吸取混合對(duì)照品貯備液50、200、300、500、750 μL，置于1 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備成分別含補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素為0.01、0.04、0.06、0.10、0.15 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果表明補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在0.010～0.150 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。回歸方程分別為:補(bǔ)骨脂素，y=78 335x-169 974(r2=0.999 6);異補(bǔ)骨脂素，y=74 076x-123 199(r2=0.999 3)。

2.6 提取方法考察 精密稱取4份粉碎后的補(bǔ)骨脂藥材0.3 g，加入適量甲醇，分別加熱回流提取1.5 h，索氏回流提取4 h，冷浸提取12 h和超聲提取30 min(2次)，提取液減壓蒸干溶劑，殘?jiān)眉状既芙廪D(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度。各提取液經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液20 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行分析，以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為考察指標(biāo)，結(jié)果表明超聲提取法對(duì)補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的提取效率佳，并且方法簡(jiǎn)單快捷，故選用超聲提取法進(jìn)行提取。

2.7 提取溶劑考察 精密稱取5份粉碎后的補(bǔ)骨脂藥材0.3 g，分別加入甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇和水20 mL，超聲提取30 min后，4 500 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL的量瓶中。藥渣用相應(yīng)溶劑重復(fù)提取一次，合并上清液于50 mL量瓶中，用相應(yīng)溶劑進(jìn)行稀釋至刻度。各提取液經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液20 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行分析，以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為考察指標(biāo)，結(jié)果表明50%甲醇對(duì)補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的提取效率最佳。

2.8 樣品溶液的制備 精密稱取粉碎后的補(bǔ)骨脂藥材0.3 g，加入50%甲醇20 mL，進(jìn)行超聲提取30 min后，4 500 r/min條件下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL的量瓶中。藥渣同法重復(fù)提取一次，合并上清液于50 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，混勻。提取液經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液20 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行分析。

2.9 精密度考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液 (60 mg/L)20 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)分析5次，以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的峰面積為考察指標(biāo)，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的RSD分別為1.32%和1.38%。

2.10 穩(wěn)定性考察 精密稱取采集于河南新鄉(xiāng)的補(bǔ)骨脂藥材0.3 g，按照樣品溶液制備項(xiàng)下制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液20 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的峰面積為指標(biāo)，計(jì)算RSD分別為1.37%和1.42%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.11 重復(fù)性考察 精密稱取6份采集于河南新鄉(xiāng)的補(bǔ)骨脂藥材0.3 g，按照樣品溶液制備項(xiàng)下制備、進(jìn)樣20 μL，記錄補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的峰面積值，計(jì)算補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，RSD分別為0.41%和1.23%。

2.12 加樣回收率考察 精密稱取6份采集于河南新鄉(xiāng)的補(bǔ)骨脂藥材0.3 g，分別精密加入對(duì)照品補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素各2.8 mg，按照樣品溶液制備項(xiàng)下制備，依法測(cè)定。計(jì)算補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的平均回收率分別為97.8%和103.1%，RSD分別為0.89%和1.13%。

2.13 樣品測(cè)定 精密稱取不同來(lái)源的補(bǔ)骨脂藥材0.3 g各3份，按照樣品溶液制備項(xiàng)下制備，測(cè)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，分析色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品溶液 (A)和樣品溶液 (B)HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference substanles(A)and Psoraleae Fructus extract

表1 不同來(lái)源補(bǔ)骨脂藥材測(cè)定結(jié)果Tab.1 Contents of psoralen and isopsoralen in Psoraleae Fructus from different sources

3 小結(jié)與討論

補(bǔ)骨脂為臨床常用中藥材，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為其主要的活性成分，利用HPLC法對(duì)其中的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素進(jìn)行測(cè)定，以前文獻(xiàn)報(bào)道利用甲醇為溶劑，超聲提取法提取效果最佳［9］;也有報(bào)道利用50%甲醇為溶劑，冷浸法提取效果最佳［13］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同比例含水甲醇作為溶劑的提取效率進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)50%甲醇為溶劑，超聲提取30 min(兩次)能夠?qū)⑺幉闹械难a(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素提取完全。對(duì)于分析流動(dòng)相的選擇，文獻(xiàn)報(bào)道中利用甲醇-酸水為流動(dòng)相，才能達(dá)到理想的分離效果［12］。本實(shí)驗(yàn)選用50%甲醇水為流動(dòng)相，等度洗脫，在保留時(shí)間15～20 min間，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素就達(dá)到了理想分離，分析周期短，分離度好。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)提取方法、提取溶劑、檢測(cè)限和定量限等指標(biāo)參數(shù)的詳細(xì)考察，建立了快速分析補(bǔ)骨脂藥材中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含有量的方法，該方法具有靈敏度高、可重復(fù)性強(qiáng)、回收率佳等特點(diǎn)，為補(bǔ)骨脂藥材及成藥的質(zhì)量控制和臨床用藥的安全有效提供了必要的參考。

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