王慶濤 高 琛 劉 暢,3 趙紅瓊 郝智慧*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心,北京 100193;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院,山東 青島 266109)

補(bǔ)骨脂又稱為破骨脂,是補(bǔ)骨脂干燥的成熟果實。通常用作驅(qū)蟲藥、壯陽藥和止瀉藥,臨床一般用于治療皮膚疾病,如牛皮癬、白皮病、麻風(fēng)和皮膚炎癥性疾病等[1]。近年來,隨著對補(bǔ)骨脂不斷的深入研究,補(bǔ)骨脂的一些活性成分具有抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤等功效也逐漸被發(fā)現(xiàn)[2]。在2015版的《中國藥典》中,有41種含有補(bǔ)骨脂的成方制劑被收錄[3-4],目前,補(bǔ)骨脂被開發(fā)形成的中成藥制劑達(dá)上百種,在皖西白鵝等動物以及人醫(yī)臨床中現(xiàn)已成為常用的補(bǔ)益類中藥,如補(bǔ)腎益腦膠囊、益腎靈顆粒等[5],但是,中國食品藥品監(jiān)督管理局已發(fā)布公告稱,以補(bǔ)骨脂為主要原料生產(chǎn)的如壯骨關(guān)節(jié)丸、白蝕丸等中成藥可能產(chǎn)生與補(bǔ)骨脂相關(guān)的肝損傷等副作用,現(xiàn)已引起國內(nèi)外研究者和醫(yī)生對補(bǔ)骨脂的用藥問題高度關(guān)注[6]。目前,利用各種提取方法對補(bǔ)骨脂的活性成分進(jìn)行提取,共發(fā)現(xiàn)了117種活性成分,其中甲基補(bǔ)骨脂黃酮A、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂甲素含量較多[7]。研究表明,使用鹽炙對補(bǔ)骨脂進(jìn)行炮制的方法,有利于有效成分的煎出[8]。然而在一些研究中顯示,補(bǔ)骨脂的主要成分中也具有產(chǎn)生肝腎毒性的物質(zhì)[7],但是其毒性物質(zhì)基礎(chǔ)往往是多種有毒成分的集合,其組成成分的化學(xué)特性各異,具體的毒性成分不明確,在相關(guān)研究中也缺乏主要成分對肝、腎毒性作用差異的比較,不能為后續(xù)的藥物開發(fā)或臨床應(yīng)用提供直觀性的參考和建議。

本研究以人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)、人肝癌細(xì)胞(Hep-G2)以及豬腎細(xì)胞(LLC-PK1)為評價模型,對比研究鹽補(bǔ)骨脂水醇提取物及其主要成分甲基補(bǔ)骨脂黃酮A、補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂甲素對HK-2細(xì)胞、Hep-G2細(xì)胞、LLC-PK1細(xì)胞的毒性差異,為后續(xù)開展補(bǔ)骨脂或補(bǔ)骨脂有效成分的相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù),在最大程度發(fā)揮其藥理作用的同時,減少其毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

HK-2、LLC-PK1細(xì)胞系購于美國ATCC細(xì)胞庫、Hep-G2細(xì)胞系,購自國家生物醫(yī)學(xué)實驗細(xì)胞資源庫。HK-2細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)100 U/mL青霉素(PG)、100 mL/L胎牛血清(FBS)、0.1 mg/mL鏈霉素(SM)的DMEM-F12完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)、LLC-PK1細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)100 U/mL PG、0.1 mg/mL SM、100 ml/L FBS的DMEM-High Glucose完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。Hep-G2細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)100 U/mL PG、0.1 mg/mL SM和100 ml/L FBS的MEM完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。將培養(yǎng)的細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)5%、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。

1.2 藥品、試劑與儀器

鹽補(bǔ)骨脂購自中國北京同仁堂有限責(zé)任公司。

鹽補(bǔ)骨脂醇提取物:使用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇對打粉后的鹽補(bǔ)骨脂進(jìn)行回流提取,加10倍量溶劑,回流提取時間為2 h,使用8層紗布收集濾液,共3次。合并3次醇提取液,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,備用。

鹽補(bǔ)骨脂水提物:鹽補(bǔ)骨脂以蒸餾水回流提取,加10倍量水后,浸泡1 h,回流提取3次(間隔時間均為2 h),間隔期間使用8層紗布收集濾液,合并3次水提取液,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,備用。

甲基補(bǔ)骨脂黃酮A、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂甲素,均購自成都德瑞克生物科技有限公司,HPLC純度均為≥98%;磷酸緩沖液(PBS),購自北京啟研生物科技有限公司;CCK-8,購自美國MedChemexpress生物科技有限公司。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 補(bǔ)骨脂提取物細(xì)胞活力測定

取鹽補(bǔ)骨脂水提取物、鹽補(bǔ)骨脂醇提取物樣品適量,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,每種成分使用培養(yǎng)基配制成0.5、1、2、3、4、5、6、7和8 mg/mL的藥液。調(diào)整細(xì)胞密度,HK-2細(xì)胞密度為10 000/孔、Hep-2細(xì)胞密度為25 000/孔、LLC-PK1細(xì)胞密度為10 000/孔,將其接種在96孔板中,37 ℃,5% CO2培養(yǎng),貼壁生長12 h后使用不含血清的對應(yīng)培養(yǎng)基,饑餓12 h后,棄掉培養(yǎng)液,給藥組加入含補(bǔ)骨脂提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5、1、2、3、4、5、6、7和8 mg/mL的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。藥物處理24 h后,棄掉藥液,隨后加入100 μL濃度為10%的CCK-8試劑,HK-2細(xì)胞和LLC-PK1細(xì)胞37 ℃孵育4 h,Hep-G2細(xì)胞37 ℃孵育2 h后,使用酶標(biāo)儀檢測吸光度(波長為450 nm),計算細(xì)胞存活率后,計算半數(shù)抑制率(IC50)。

1.3.2 補(bǔ)骨脂主要活性成分細(xì)胞活力測定

取甲基補(bǔ)骨脂黃酮A、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂寧、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂定,每種成分以DMSO配制成50 mmol/L濃度的儲備液。試驗時將其以培養(yǎng)基分別配制成25、50、75、100、125、150、175和200 μmol/L藥液,對照組為含體積分?jǐn)?shù)0.4%的DMSO。細(xì)胞鋪板同1.3.1.1。給藥組加入含不同補(bǔ)骨脂的主要成分(25、50、75、100、125、150、175和200 μmol/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,藥物處理24 h后,棄掉藥液。隨后同1.3.1中使用CCK-8法測定細(xì)胞存活率,并計算IC50值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9分析軟件處理。采用Excel 2021軟件進(jìn)行作圖,與對照組相比,*P<0.05表示差異顯著,**P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)骨脂提取物對HK-2細(xì)胞活力的影響

給藥培養(yǎng)24 h后檢測,發(fā)現(xiàn)鹽補(bǔ)骨脂醇提取物、水提取物能夠抑制HK-2細(xì)胞的活力。24 h的IC50值顯示,在相同給藥條件下,鹽補(bǔ)骨脂水提取物的IC50值為1.736 mg/mL,鹽補(bǔ)骨脂醇提取物的IC50值為0.558 mg/mL。由此可見,鹽補(bǔ)骨脂水提取物的毒性小于鹽補(bǔ)骨脂醇提取物(圖1)。

(a)鹽補(bǔ)骨脂水提取物;(b)鹽補(bǔ)骨脂乙醇提取物。(a) Water extract of salt Psoraleae Fructus; (b) Ethanolic extract of salt Psoraleae Fructus.圖1 不同鹽補(bǔ)骨脂提取物對HK-2細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of different salt Psoraleae Fructus extracts on the viability of HK-2 cells

2.2 補(bǔ)骨脂主要成分對HK-2細(xì)胞活力的影響

給藥培養(yǎng)24 h后檢測,發(fā)現(xiàn)甲基補(bǔ)骨脂黃酮A、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂定能夠抑制HK-2細(xì)胞的活力,而補(bǔ)骨脂寧在本試驗劑量下沒有顯著毒性(P>0.05)。24 h的IC50值排序為(補(bǔ)骨脂寧>補(bǔ)骨脂素>異補(bǔ)骨脂素>異補(bǔ)骨脂定>補(bǔ)骨脂定>甲基補(bǔ)骨脂黃酮A>補(bǔ)骨脂乙素>補(bǔ)骨脂甲素)。24 h的IC50值顯示,在相同給藥條件下,補(bǔ)骨脂甲素對HK-2 細(xì)胞毒性較其他成分對HK-2細(xì)胞的毒性強(qiáng)。此外,還比較了補(bǔ)骨脂主要成分與馬兜鈴酸A對于HK-2細(xì)胞的毒性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基補(bǔ)骨脂黃酮A、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂定的毒性強(qiáng)于馬兜鈴酸A(圖2)。

(a)補(bǔ)骨脂素;(b)甲基補(bǔ)骨脂黃酮A;(c)異補(bǔ)骨脂定;(d)異補(bǔ)骨脂素;(e)補(bǔ)骨脂寧;(f)補(bǔ)骨脂定;(g)補(bǔ)骨脂乙素;(h)補(bǔ)骨脂甲素;(i)馬兜鈴酸A。(a) Psoralen; (b) Bavachinin A; (c) Isopsoralidin; (d) Isopsoralen; (e) Corylin; (f) Psoralidin; (g) Isobavachalcone; (h) Bavachin; (i) Aristolochic acid A.圖2 補(bǔ)骨脂主要成分對HK-2細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of the main components of Psoraleae Fructus on the viability of HK-2 cells

2.3 補(bǔ)骨脂提取物對Hep-G2細(xì)胞活力的影響

給藥培養(yǎng)24 h后檢測,發(fā)現(xiàn)鹽補(bǔ)骨脂醇提取物、水提取物能夠抑制Hep-G2細(xì)胞的活力。24 h的IC50值顯示,在相同給藥的條件下,鹽補(bǔ)骨脂水提取物的IC50值為3.891 mg/mL,鹽補(bǔ)骨脂醇提取物的IC50值為1.049 mg/mL,由此可見,鹽補(bǔ)骨脂水提取物的毒性要小于鹽補(bǔ)骨脂醇提取物。研究顯示,美國每年因?qū)σ阴０被右鸬募毙愿喂δ芩ソ?AHF)的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(1998年21%,2003年51%)[9],所以對比分析鹽補(bǔ)骨脂醇提取物、水提取物和對乙酰氨基酚對于Hep-G2細(xì)胞毒性的影響,發(fā)現(xiàn)鹽補(bǔ)骨脂水提取物的毒性要小于對乙酰氨基酚,但是鹽補(bǔ)骨脂乙醇提取物的毒性大于對乙酰氨基酚(圖3)。

2.4 補(bǔ)骨脂主要成分對Hep-G2細(xì)胞活力的影響

給藥培養(yǎng)24 h后檢測,發(fā)現(xiàn)甲基補(bǔ)骨脂黃酮A、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂定能夠抑制Hep-G2細(xì)胞的活力,而補(bǔ)骨脂寧在本試驗劑量下基本沒有毒性(P>0.05)。24 h的IC50值排序為(補(bǔ)骨脂寧>補(bǔ)骨脂素>異補(bǔ)骨脂定>異補(bǔ)骨脂素>補(bǔ)骨脂定>補(bǔ)骨脂乙素>甲基補(bǔ)骨脂黃酮A>補(bǔ)骨脂甲素)。IC50值顯示,在相同給藥條件下,補(bǔ)骨脂甲素對Hep-G2細(xì)胞毒性較其他成分對Hep-G2細(xì)胞的毒性強(qiáng)(圖4)。

2.5 補(bǔ)骨脂提取物對LLC-PK1細(xì)胞活力的影響

在給藥培養(yǎng)24 h后檢測,發(fā)現(xiàn)鹽補(bǔ)骨脂醇提取物、水提取物能夠抑制LLC-PK1細(xì)胞的活力。24 h的IC50值顯示,在相同給藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下,鹽補(bǔ)骨脂水提取物的IC50值為1.759 mg/mL,鹽補(bǔ)骨脂醇提取物的IC50值為0.737 mg/mL。由此可見,鹽補(bǔ)骨脂水提取物的毒性要小于鹽補(bǔ)骨脂醇提取物(圖5)。

(a)鹽補(bǔ)骨脂水提取物;(b)鹽補(bǔ)骨脂乙醇提取物;(c)對乙酰氨基酚。(a) Water extract salt Psoraleae Fructus; (b) Ethanolic extract of salt Psoraleae Fructus; (c) Acetaminophen.圖3 不同鹽補(bǔ)骨脂提取物對Hep-G2細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of different salt Psoraleae Fructus extracts and acetaminophen on the viability of Hep-G2 cells

(a)補(bǔ)骨脂素;(b)甲基補(bǔ)骨脂黃酮A;(c)異補(bǔ)骨脂定;(d)異補(bǔ)骨脂素;(e)補(bǔ)骨脂寧;(f)補(bǔ)骨脂定;(g)補(bǔ)骨脂甲素;(h)補(bǔ)骨脂乙素。(a) Psoralen; (b) Bavachinin A; (c) Isopsoralidin; (d) Isopsoralen; (e) Corylin; (f) Psoralidin; (g) Bavachin; (h) Isobavachalcone.圖4 補(bǔ)骨脂主要成分對Hep-G2細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effect of the main components of Psoraleae Fructus on the viability of Hep-G2 cells

(a)鹽補(bǔ)骨脂水提取物;(b)鹽補(bǔ)骨脂乙醇提取物。(a) Water extract of salt Psoraleae Fructus; (b) Ethanolic extract of salt Psoraleae Fructus.圖5 不同鹽補(bǔ)骨脂提取物對LLC-PK1細(xì)胞活力的影響Fig.5 Effect of different salt Psoraleae Fructus extracts on the viability of LLC-PK1 cells

3 討論與結(jié)論

由于中藥具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)綜合作用的整體性特點(diǎn),其毒性物質(zhì)基礎(chǔ)往往是多種有毒成分的集合,且組成成分的化學(xué)特性各異,有些成分毒-效關(guān)系不明確,這也增加了中藥毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究的難度,需借助有效的方法明確中藥毒性物質(zhì)。

補(bǔ)骨脂最早記載于《雷公炮炙論》,未言明其毒性。但近年來,國內(nèi)外學(xué)者對補(bǔ)骨脂及其制劑肝腎毒性的關(guān)注度越來越高[10]。如王宇等[11]發(fā)現(xiàn)對鼠使用灌胃的給藥方式給予補(bǔ)骨脂乙醇提取物后,相關(guān)膽汁合成和轉(zhuǎn)運(yùn)酶受到破壞,發(fā)生膽汁淤積型的肝臟損傷,且補(bǔ)骨脂的毒性呈性別依賴性,對雌性大鼠更易造成肝臟損傷,又如Wang等[12]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂甲素等黃酮類成分可通過抑制肝臟微粒體中的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1,從而使膽紅素水平升高,造成肝臟毒性。本研究依據(jù)補(bǔ)骨脂致肝、腎損害的藥理學(xué)特點(diǎn),以HK-2細(xì)胞、Hep-G2細(xì)胞及LLC-PK1作為研究對象,以細(xì)胞活力作為檢測指標(biāo),對鹽補(bǔ)骨脂水、醇提取物及其主要成分對于各細(xì)胞的毒性進(jìn)行評估。結(jié)果表明鹽補(bǔ)骨脂醇提取物及水提取物可能對肝、腎損傷產(chǎn)生影響,且鹽補(bǔ)骨脂醇提取物對于肝、腎細(xì)胞的毒性要大于補(bǔ)骨脂水提取物。尤力都孜等[13]和阿卜杜米吉提等[14]研究表明,使用補(bǔ)骨脂乙醇提取物給小鼠灌胃后發(fā)現(xiàn),其肝臟呈現(xiàn)明顯的損傷,且郭兆娟[15]在使用水和乙醇對鹽補(bǔ)骨脂進(jìn)行提取后,其鹽補(bǔ)骨脂水提取物中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂定等毒性成分明顯少于乙醇提取物,含量差異較大,在使用肝細(xì)胞對比研究后發(fā)現(xiàn),補(bǔ)骨脂醇提取物對于肝細(xì)胞的毒性要大于補(bǔ)骨脂水提取物,其結(jié)果與本試驗的結(jié)果相一致。由此可知,不同的提取方式可能會影響補(bǔ)骨脂的毒性,其原因可能是鹽補(bǔ)骨脂在使用乙醇提取后,其毒性成分發(fā)生了改變。一些相關(guān)研究表明在補(bǔ)骨脂醇提取物中有效成分的含量要高于水提取物[15],在未來的應(yīng)用中,怎樣平衡兩者之間的關(guān)系,是以后需要進(jìn)行探討的問題。

毒性成分方面,甲基補(bǔ)骨脂黃酮A、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、異補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素可能是補(bǔ)骨脂致肝、腎細(xì)胞損傷的潛在成分,在HK-2細(xì)胞和Hep-G2細(xì)胞中,補(bǔ)骨脂甲素的毒性均大于補(bǔ)骨脂其他主要成分。在本研究中,雖然使用了2種不同物種細(xì)胞進(jìn)行比較,但是在有毒成分作用的細(xì)胞中,都呈現(xiàn)出了劑量依賴性的毒性。研究表明,在使用異補(bǔ)骨脂素灌胃后發(fā)現(xiàn),大鼠的腎臟系數(shù)升高,體重減輕,血清中尿素氮含量顯著升高,經(jīng)病理組織學(xué)檢查后發(fā)現(xiàn),腎臟遠(yuǎn)曲小管皮質(zhì)層出現(xiàn)了明顯的空泡變性,說明異補(bǔ)骨脂素可引起大鼠腎毒性[16-18],而吳婭麗等[19]使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選補(bǔ)骨脂毒性成分的推測與本研究結(jié)果相符。

對乙酰氨基酚是解熱鎮(zhèn)痛藥的一種,過量使用是造成藥物性肝損傷主要原因之一[20],而馬兜鈴酸A是馬兜鈴酸中主要的組成物質(zhì),其靶器官為腎臟,長期使用含馬兜鈴酸A的藥物會導(dǎo)致馬兜鈴酸腎病,嚴(yán)重時會發(fā)展成終末期腎病[21]。本研究對鹽補(bǔ)骨脂的提取物與對乙酰氨基酚、補(bǔ)骨脂的毒性成分與馬兜鈴酸A的毒性分別進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)其毒性成分中的甲基補(bǔ)骨脂黃酮A、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂定的毒性要大于馬兜鈴酸A,鹽補(bǔ)骨脂乙醇提取物的毒性要大于對乙酰氨基酚,從側(cè)面說明了鹽補(bǔ)骨脂及其毒性成分對肝、腎毒性的程度。

因此根據(jù)本研究結(jié)果,可在后續(xù)深入研究其體內(nèi)外肝、腎損傷及機(jī)制和臨床應(yīng)用時,選擇合適的有效成分或提取方式,為后續(xù)的研究提供科學(xué)依據(jù)。本研究存在一些局限性,使用HK-2腎小管上皮細(xì)胞、LLC-PK1豬腎細(xì)胞以及Hep-G2人肝癌細(xì)胞進(jìn)行體外試驗并不能完全反映藥物對于機(jī)體的毒副作用。因此,后續(xù)試驗將基于以上結(jié)果,開展補(bǔ)骨脂水、醇提取物及其主要成分體內(nèi)毒性的比較及相關(guān)的體內(nèi)外機(jī)制方面的研究。此外,一些研究表明,不同動物種屬及性別存在藥物毒性的差異,后續(xù)我們將根據(jù)試驗結(jié)果,開展不同種屬、性別方面的研究,為后續(xù)深入研究補(bǔ)骨脂毒性及其機(jī)制提供試驗依據(jù),也為含補(bǔ)骨脂中成藥的減毒研究提供思路。

綜上所述,鹽補(bǔ)骨脂水提取物、醇提取物對HK-2細(xì)胞、Hep-G2細(xì)胞及LLC-PK1細(xì)胞均具有一定的細(xì)胞毒性,且鹽補(bǔ)骨脂醇提取物毒性更大;補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、甲基補(bǔ)骨脂黃酮A、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂定對HK-2細(xì)胞、Hep-G2細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性,且補(bǔ)骨脂甲素的毒性要大于補(bǔ)骨脂其他主要成分。